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磁珠的DNA纯化自动化解决方案操作流程详解

2023-02-15     来源:本站     点击次数:1862

使用基于磁珠的DNA纯化已成为NGS文库制备的金标准。尽管这是一种快速简便的方法,但高通量测序成本的降低和单细胞测序的普及使待处理的样本大大地增加。C.WASH兼容磁性板载体,采用独特的非接触式注液和反向离心移除液体的方式,支持在96和384微孔板中自动完成基于磁珠的DNA纯化这一工作流程。
 
C.WASH是一种非接触式微孔板样品处理系统,其反向离心技术可以快速且可重复地去除96、384和1536孔板上残留量非常低的液体,此时特制的磁吸支架将磁珠吸附在孔底,以达到清洗和收集磁珠的目的。同时非接触式注液技术能够快速均匀地添加乙醇等试剂,避免了孔间的交叉污染。
 

图1. C.WASH非接触式微孔板样品处理系统

C.WASH的这些功能有助于简化和标准化磁珠清洗,加快NGS文库制备工作流程,并确保在液体移除或试剂分配过程中不会发生孔间交叉污染。
 
一、C.WASH的评估及案例展示  

案例一:使用C.WASH进行DNA自动纯化样品交叉污染的可能性

在此实验中,我们利用哺乳动物基因组DNA中占很大比例的串联重复序列对C.WASH进行评估,因为主要卫星重复序列(MSRs)由234个碱基对(bp)单体的重复序列组成,这些单体在着丝粒周围区域富集并参与异染色质的形成。它们在基因组中的丰度以及相对较小的长度使MSR成为定量聚合酶链式反应(qPCR)中检测交叉污染的理想指标。

图2为使用C.WASH纯化的工作流程:
1. 使用C.WASH移除上清液(离心力10g)
2. 使用C.WASH加入70%乙醇(20µL),等待30s
3. 使用C.WASH移除70%乙醇(离心力10g)
4. 使用C.WASH重复乙醇洗涤(步骤2和3)
5. 在室温下放置样品2min
6. 使用C.WASH加入20µL 超纯水,孵育2min以重新水合
图2.C.WASH在384孔板中自动DNA纯化工作流程


图3. C.WASH DNA纯化工作流程没有交叉污染 
A) 384孔板中纯化方案的布局。前两列是磁珠和细胞裂解物的混合物(+DNA)或磁珠和水的混合物(-DNA)。B) qPCR扩增后获得的每个孔的循环阈值。C) 表示在扩增周期内每个样本的Rn值(normalized reporter value)扩增曲线。

实验结果
  1. C.WASH可防止微孔板上样本间的交叉污染(图3)。
  2. C.WASH兼容高通量384孔磁珠的清理。
  3. 与传统的手动方法相比,C.WASH减少了磁珠的清理时间和成本。

案例二:scRNA-seq文库制备中的DNA纯化

将HEK293FT(人类)和NIH3T3(小鼠)细胞经FACS分选后,交替铺到384孔板上,中间一行(H)作为阴性对照,如图4所示。经Smart-seq3仪器合成和扩增cDNA后,分别使用C.WASH和另外一种液体处理仪器BRAVO对磁珠进行清洗,并对比清洗效果。
表1. BRAVO和C.WASH的磁珠清洗流程对比


图4. C.WASH和BRAVO实现文库的可视化


图5. 使用C.WASH和BRAVO清洗后相应基因组的读取数

实验结果
  1. C.WASH整个清洗过程只需要2分钟的时间,相比BRAVO,C.WASH能更进一步加快NGS文库制备工作流程(表1)。
  2. C.WASH提供独立的操作程序,可以与自动化的高通量工作流程无缝集成,提高每天需要处理的样品和微孔板的数量(图4)。
  3. 使用C.WASH所得到的结果显示,它能够避免交叉污染,从而有效地保护PCR扩增的cDNA片段(图5)。

案例三:采用C.WASH纯化PCR产物的DNA

SMART-seq2文库制备后,分别对未纯化的cDNA进行手工清洗和使用C.WASH清洗,然后通过生物分析仪检测对比结果。

图6. 手工清洗和C.WASH清洗DNA纯化中的磁珠工作流程示意图


图7. 手工清洗和C.WASH清洗结果对比图

实验结果
  1. 手工清洗非常耗时,C.WASH将关键的步骤减少到仅5min,比传统手动操作快5倍,同时不需要消耗枪头(图6)。
  2. 通过对比生物分析仪的结果,可以看到C.WASH与手工清洗相比,在DNA纯化方面达到了相同的清洗效果,并且C.WASH清洗速度更快(图7)。
  3. 非接触式的分液方式,不仅节省了时间,还节省了枪头,降低了实验成本。
 
二、C.WASH系统优势  


1. 非接触式清洗
通过非接触式注液和孔板清洗,避免交叉污染。
2. 支持多种微孔板尺寸
能够温和地从任何SBS格式的96、384、1536孔板中去除液体。
3. 低残余量
残留体积小于0.1µl,高效洗涤效率减少了所需的洗涤循环次数。
4. DNA纯化
由于采用了磁性板载体,NGS文库的制备速度更快。
5. 快速、自动化
自动化和独立的操作使其可以在1分钟内在96或384孔板中完成1次洗涤循环。

 
三、C.WASH其他应用领域  

C. WASH不仅可以应用于基于磁珠的DNA纯化,其创新的清洗方式,还可以在其他领域发挥出重要作用:

1. 细胞实验
C.WASH自动化完成典型筛选工作流程中的所有清洗和分配步骤,已成为HTS环境中药物发现或基因编辑的重要设备。

2. 免疫测定
ELISA是非常敏感的免疫测定,因此交叉污染和/或移液不准确可能导致高变异系数(CV)。C.WASH精确的非接触式分液避免了交叉污染,因此降低了CV。此外,洗涤后的较低残留体积可提高洗涤效率,并减少所需的洗涤次数。

3. 悬浮细胞
可以使用C.WASH作为一种简单且可重复的方法来清洗悬浮细胞。在将平板离心获得细胞沉淀后,使用C.WASH排空液体上清液,与手动工作流程相比,洗涤液的残余体积持续较低,细胞回收率更大。

4. 平板图层
用蛋白质或多肽包被的孔板可以提高细胞对微孔板的吸附能力。使用C.WASH向孔板内注入涂层溶液,选择培养时间,清洗和干燥板,以获得合适的涂层,可以简化实验室中的涂层过程。

 
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