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核酸提取实验原理、纯化方法及应用领域

2024-04-17     来源:本站     点击次数:580

核酸提取作为分子实验的“第一步”,几乎是所有实验的基本,PCR、qPCR、建库测序等都需要核酸才能顺利进行。核酸提取纯化质量是保证后续检测数据准确性的前提。
 

一,什么是核酸酶

核酸是一类由核苷酸聚合成的生物大分子,是构成生命所必需的基本物质之一,在生命系统中主要起到作为遗传信息载体的作用,主要分为脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA),其中RNA又可以根据功能的不同分为核糖体RNA(r RNA),信使RNA(m RNA)和转运RNA(t RNA)等。
 

核酸广泛存在于所有动植物细胞、微生物内、生物体内,常与蛋白质结合形成核蛋白。不同的核酸,其化学组成、核苷酸排列顺序等不同。DNA主要集中在细胞核内,线粒体和叶绿体中,而RNA主要分布在细胞质当中。


二,核酸提取类型

1,总RNA提取

总RNA中,75-85%为rRNA(主要是28S-26S/23S和18S/16S rRNA),其余的由分子量大小和核苷酸序列各不相同的mRNA和小分子RNA如tRNA、5S rRNA、5.8S rRNA、miRNA、siRNA、小核RNA(small nuclear RNA,snRNA)及核仁小分子RNA(small nuceolar RNA,snoRNA)等组成。


2,miRNA提取

MicroRNAs(miRNAs)是小型的、高度保守的RNA分子,如小干扰RNAs(siRNAs),通过与他们的碱基配对调节其同源mRNA的分子表达,以预防通过各种机制的表达。他们已成为进行发育、细胞增殖、分化和细胞周期的重点监管机构。


3,基因组DNA提取

进行基因结构和功能研究以及基因诊断,通常要求得到的片段长度不小于100~200kb。在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素,以保证DNA的完整性,为后续的实验打下基础。


4,质粒抽提

质粒抽提方法即去除RNA,将质粒与细菌基因组 DNA分开,去除蛋白质及其它杂质,以得到相对纯净的质粒。


5,cfDNA提取和cfRNA提取


三,传统核酸酶提取实验原理

核酸提取实验涉及到两个基本原理:细胞裂解和核酸沉淀。

1,细胞裂解是将DNA从细胞壁和细胞膜中释放出来的过程,在此过程中,各种物理和化学手段如冰冻-破碎、酶解和离子交换等可以使细胞破裂,释放出核酸;

2,核酸沉淀则是将DNA从其他杂质中分离出来的过程。这里的关键技巧是利用离心机和酒精洗涤。离心机的高速旋转让细胞碎片沉积在管底,而酒精则帮助DNA在管壁上形成白色絮状物,方便我们提取。


四,核酸提取纯化方法解决

1,煮沸裂解法

此法一般用于DNA的手工提取。染色体DNA比质粒DNA分子大很多,且染色体DNA为线状分子,而质粒DNA为共价闭合环装分子;当加热处理DNA溶液时,线状染色体DNA容易发生变性,共价闭合的质粒DNA在冷却时即恢复其天然构象;变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀,而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中,从而可通过离心将两者分开。


2,磁珠法

对超顺磁性纳米颗粒的表面进行改良和表面修饰后,制备成超顺磁性氧化硅纳米级磁珠。该磁珠能与核酸分子特异性结合。利用氧化硅纳米微球的超顺磁性,在Chaotropic盐(盐酸胍、异硫氰酸胍等)和外加磁场的作用下,从血液、动物组织、食品、病原微生物等样本中分离出DNA和RNA。





3,酚氯仿抽法

主要是使用两种不同的有机溶剂交替抽提将蛋白去除。用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA的联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶,同时苯酚抑制了DNase的降解作用,蛋白质分子溶于酚相,而DNA溶于水相。离心分层后取出水层,多次重复操作,再合并含DNA 的水相,利用核酸不溶于醇的性质,用乙醇沉淀DNA。离心后,DNA可取出。


4,阴离子去污剂法

用SDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性,可以直接从生物材料中提取DNA。由于细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,同时阴离子去污剂能够破坏这种价键,所以常用阴离子去污剂提取DNA。


5,离心柱法

通过特殊硅基质吸附材料,能够特定吸附DNA,而RNA和蛋白质顺利通过,然后利用高盐低PH结合核酸,低盐高PH值洗脱,来分离纯化核酸。离心柱纯化也是试剂盒提取中广泛的使用方法。

 


6,热裂解碱法

碱裂解法是基于DNA的变性与复性差异而达到分离目的的。碱性使质粒DNA变性,再将pH值调至中性使其复性,复性的为质粒DNA,而染色体DNA不会复性,缠结成网状物质,通过离心除去。


7,CTAB法原理(植物DNA提取经典方法)

CTAB(hexadecyltrimethylammoniumbromide,十六烷基三甲基溴化铵),是一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中(>0.7mol/L NaCl),CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物,只是不能沉淀核酸。通过有机溶剂抽提,去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。


8,其他方法

除了上述常用的方法之外,还有超声法、酶解法及浓盐法等等多种方法。


五,核酸分离注意事项与方案选择

1,注意事项

分离纯化核酸时,为了保证核酸结构与功能的研究,完整的一级结构是最基本的要求,因为遗传信息全部贮存在一级结构之中,核酸的一级结构还决定其高级结构的形式以及和其它生物大分子结合的方式。

➤ 尽量简化操作步骤,缩短提取过程,以减少各种有害因素对核酸的破坏;

➤ 减少化学因素对核酸的降解,为避免过酸、过碱对核酸链中磷酸二酯键的破坏,操作多在 pH4 - 10 的条件下进行;

➤ 减少物理因素对核酸的降解,物理降解因素主要是机械剪切力,其次是高温;

➤ 防止核酸的生物降解,细胞内或外来的各种核酸酶消化核酸链中的磷酸二酯键,直接破坏核酸的一级结构。

2,方案选择

想要拿到好实验结果,我们应该先学会根据具体的实验材料和实验要求来选择合适的方法。核酸提取的方案,应根据具体生物材料和待提取的核酸分子的特点而定,对于某特定细胞器中富集的核酸分子,事先提取该细胞器,然后提取目的核酸分子的方案,可获得完整性和纯度两方面质量均高的核酸分子。


六,核酸纯化提取应用领域

核酸纯化系统/核酸提取仪广泛应用于生命科学研究和临床诊断中的核酸提取和纯化过程。具体应用包括以下几个方面:
1,基因组学研究:核酸纯化系统可以用于从细胞、组织或体液样本中提取并纯化核酸,为基因组测序、SNP分析、CNV和突变检测等提供高质量的DNA/RNA样品。

2,蛋白质研究:核酸纯化系统可以用于从细胞裂解液中去除蛋白质,使得后续的核酸分析更加准确和灵敏。在研究蛋白质-DNA/RNA相互作用、染色质组装和修饰等方面具有重要作用。

3,临床诊断:核酸纯化系统在临床诊断中非常重要。它可以用于从患者样本中提取并纯化病原体的核酸,以进行疾病诊断、药物敏感性分析和基因检测等。常见的应用包括病毒核酸提取、细菌分离和基因突变筛查等。

4,法医学和遗传学:核酸纯化系统可以用于DNA提取和纯化,以进行法医学鉴定、亲子关系鉴定、人类遗传学研究等。这些研究和应用需要高质量的DNA样本,核酸纯化系统能够提供符合要求的纯化效果。


逐典Pannarase全能核酸酶优势:

1.无动物源性、无氨苄青霉素

2.杰出单位比酶活、更高效的核酸降解能力

3.先进的生产工艺,非传统His标签纯化、排除引入金属离子风险

4.严格的质控标准,内毒水平低,确保单位酶活的准确性以及批次间稳定性


全能核酸酶应用条件:

全能核酸酶的酶活会受到多种因素的影响(例如温度、pH、离子强度等),故用量范围也会从0.1 U/mL-250 U/mL不等。因此,不同的操作环境下酶的最佳浓度不同,需要通过实验设置梯度进行最佳条件的摸索。

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