前言：今天是第16个“国际罕见病日”，主题为“Share your colours”，中文译为“点亮生命的色彩”。根据《中国罕见病定义研究报告2021》，罕见病的定义为新生儿发病率小于万分之一、患病率小于万分之一、患病绝对人数小于14万的疾病。
 
尽管我国于2022年迎来人口负增长的时代，但庞大的人口数量和环境、饮食等因素的影响，我国患罕见病的总人数并不少。新生人口数量的断崖式下降，意味着新生人口的质量将更受重视，倡导“优生优育”的政策支持力度势必会进一步加大。为保证新生儿出生质量，出生缺陷的相关筛查尤为重要，例如唐氏综合征，脊髓性肌萎缩症，脆性X染色体综合征，遗传性耳聋，地中海贫血综合症，子痫等等。其中，与新生儿智力及发育障碍的筛查更是重中之重。
 
01脆性X染色体综合征简介
众所周知，唐氏综合征（21号染色体三体综合征）是引起新生儿智力和发育障碍的最主要因素。随着基于二代测序技术（NGS）的无创产前检测筛查（NIPT）在我国的大力推广和广泛普及，对唐氏综合征的防控取得了非常显著的临床及社会效益。而仅次于唐氏综合征，为引起智力及发育障碍的第二大病因的脆性X染色体综合征（Fragile X Syndrome，FXS）[1]，人们却普遍缺乏关注和认知。脆性X染色体综合征是继唐氏综合症之后导致智力残疾的第二大原因，也是导致智力及发育障碍的第一大单基因遗传病，更是男性智力残疾的最普遍原因。鉴于该病的相对高发生率及其复杂的临床管理（尚无有效的药物和疗法），罹患疾病将给患者及其家庭造成严重的经济负担和精神负担[2]。
 
脆性X染色体综合征的患者一条X染色体的长壁2区7带（Xq27）到长壁的2区8带（Xq28）之间的染色体结构呈细丝样，表现在X染色体的长臂末端出现“缢沟”，这段连接较细而致其相连的末端呈随体样的结构，参见图1[3]。由于这一细丝样的部位易发生断裂、丢失，因而被称为脆性部位。脆性部位发生上述改变而引发的疾病被称为脆性X染色体综合征，属于X连锁显性遗传病。脆性X染色体综合征迄今尚无针对性疗法，更无法治愈。  
临床表型范围广
FXS主要涉及中枢神经系统，不仅表现为孤立的智力障碍，而且表现为多系统疾病。男性FXS患者多且症状较严重，典型的症状为：特殊的面容（长条面型），主要是大耳朵和耳朵外凸、大嘴、前额突出、突下颌（参见图2）；智力发育障碍，语言障碍、行为异常（多动、冲动、焦虑及癫痫发作），对外界刺激反映迟钝等；大睾丸即巨睾症等。女性常为携带者，女性携带者约1/3表现出智力低下或其他症状，但大多数较轻；女性FXS患者症状较轻，主要是精神问题、轻度的认知损害、易害羞和焦虑、奇怪的交流方式和怪癖等[4]。
FXS还与自闭症（ASD）和多动症（ADHD）存在密切关系。在所有被诊断患有ASD的病例中，约有2%归因于FXS。而超过60%的FXS儿童被诊断患有ADHD，ASD或两者兼有[5]。FXS是ASD的主要已知遗传原因，有20%的ASD病例被认为是单基因突变的结果，只有2%至6%是由于FMR1基因突变[6]。值得额外重视的是，我国的ASD患者已突破1300万，其中超过300万人为14岁以下的儿童，特别是近年来我国城市儿童中ASD发生率呈现出上升趋势。  
发病率不容忽视
全球每4000名男性和每8000名女性中就分别有1人患病。致病前突变在普通人群中则更为普遍，约每250-300名女性、每850名男性中就分别有1人是携带者[7]。目前尚缺乏中国人群的患病率信息，也从侧面说明尚引起国人的足够重视。FXS大致占到男性智力低下患者的4%到8%。在女性人群中相应来的略低。在一般人群中随机选择的300名女性中就有一名可能产下受影响的男婴。
 
分子病因
FXS是由于脆性X智力低下蛋白（FMRP）缺失引起。FMRP缺失的主要机制是编码FMRP的 FMR1基因的5’UTR区CGG三核苷酸重复动态扩增异常，导致该区域异常甲基化，随后发生转录沉默，即异常扩增引起转录过程受阻，参见图3[8]。FXS本质上是一种三核苷酸重复扩增的动态突变疾病。FMR1基因的CGG核酸三联体重复的数目（CGG）n会导致三种不同的疾病状态，具体取决于重复次数和性别。 (A) 携带 <45 个 CGG 重复的等位基因表达和翻译正常；
(B) CGG重复扩增到突变前范围（包含55-200个CGG重复序列）导致FMR1 mRNA转录本上调，但FMRP蛋白水平表现出一定的降低，此外，还会翻译产生有害的polyG蛋白物（红色形状）；
(C) CGG重复扩增到整个突变范围（200+重复）导致FMR1基因的高甲基化，导致转录和翻译的完全沉默，FMRP蛋白缺失。
 
（1）正常型：健康个体的CGG重复次数少于44次。
（2）中间突变型和前突变型：FMR1中间和前突变携带者的重复数分别在45-54和55-200之间，与正常个体相比，FMRP蛋白水平下降。中间和前突变增加了这些携带者发展为男性的FXTAS（脆性X相关性震颤／共济失调综合征）和女性的FXPOI（原发性卵巢功能不全）两种疾病的风险和概率。在女性中，55-200个重复等位基因可能因月经初潮缺失或卵泡过早耗竭而表现为FXPOI。
（3）全突变型：在重复超过200次的情况下称为完全突变型，FMR1基因高甲基化和完全沉默，这是FXS的主要原因。当（CGG）n重复数超过200时则为完全突变，常伴有CpG岛异常甲基化，使FMR1无法正常被转录翻译出正常的FMRP蛋白。  
（4）导致FXS的其他变异：除FMR1启动子区域的CGG扩增外，少数FXS病例是由编码区突变或FMR1基因缺失引起的。FMR1基因内单核苷酸变异（SNVs）、短的插入或缺失（InDel）和微缺失，以及包含部分或整个FMR1基因座的缺失尽管少见，但也能引起FMRP的表达异常或者产生不同功能的FMRP，从而形成类似脆性X染色体综合征的临床症状[9，10，11]。目前的研究表明，有近5%的FXS是由这些变异所导致的。  
除了CGG重复次数的多少之外，插入的AGG可中断CGG的重复，在一定情况下可降低携带突变前等位基因的女性将完全突变传递给后代的风险。在没有AGG插入的母体等位基因，子代发生FRM1全突变扩增的风险最大，而即使存在单个AGG插入也会显着降低这种风险，特别是对于重复次数<70的等位基因。当重复次数超过70个CGG三联体时，即使存在AGG插入中断，等位基因也表现出高度的不稳定性，当CGG重复数超过90时，AGG插入中断则没有任何能力阻止三联体的动态扩增。
 
特别注意本病的前突变的传递方式即表型正常的男性，传递者的前突变基因传递给女儿的时候，重复突变不变或者减少。无临床症状的前突变的女性携带者在传递给下一代时，重复数目明显增加，后代可出现男性患者，通常由前突变发生动态扩增为，全突变的概率约为80%，前突变重复数目越多。女性配子减数分裂过程中，动态扩增的可能性就越大，越易产生全突变。
 
02FXS的诊断与筛查
临床诊断
脆性X综合征通过临床表现和染色体检查两方面结合进行临床诊断，可以促进FXS中基因型 - 表型相关性的研究，并为患者及其亲属提供更有效的诊断和遗传咨询。
 
疾病筛查
美国儿科学会目前的建议有智力障碍、整体发育迟缓或突变或突变前疾病家族史的人均应进行FXS的诊断与筛查，适合进行FXS筛查与诊断的人群有：
（1）育龄女性：脆性X综合征是一种发病率仅次于唐氏综合征的疾病；女性携带者生产的子代患病机率可高达25%（男孩高达50%），建议所有育龄女性都要接受脆性X综合征产前筛查。
（2）脆性X综合征疑似人群：有不明原因智力低下、发育迟缓、自闭症／孤独症、多动症、狂躁症、行为障碍和语言障碍的儿童诊断检测。
（3）胎儿（孕妇为脆性X前突变携带者）：当母亲为脆性X综合征前突变携带者时，建议对胎儿行产前检测。
（4）其他脆性X前突变携带者：脆性X综合征家族史的人群，不明原因智力低下家族史的人群，有卵巢早衰、绝经过早及其家族史的人群，不孕、早产、胎停育、反复流产的女性，有震颤／共济失调及其家族史的人群。
 
产前筛查
FXS分子测试通常采集外周血淋巴细胞使用临床推荐的方法进行检测。此外，还可以使用基于LR-PCR的方案对绒毛膜绒毛或羊膜细胞的DNA进行FXS的产前测试。目前，根据ACMG（美国医学遗传学学院）和ACOG（美国妇产科医师大会）指南，有以下个人或家族史的夫妇应进行FMR1产前检测：
（1）存在FXS或FX相关疾病史；
（2）存在不明原因的智力障碍或发育迟缓；
（3）存在孤立性认知障碍；
（4）自闭症；
（5）单纯性小脑性共济失调伴震颤等。
 
此外，鉴于FXS在普通人群中的发病率较高，一定比例的遗传健康专家支持对所有要求进行分析的女性进行产前检测，无论其个人／家族史如何。
 
03分子诊断与筛查的技术方法
临床上常用的FXS诊断方法有：脆性X染色体核型分析；分子诊断方法，如：三重复引物 PCR 法（triple repeat–primed PCR,TP–PCR）联合毛细管电泳（CE）片段分析法、DNA印迹杂交法（Southern blot, SB）等。此外，还可以对CGG甲基化程度进行测试以评估FMRP是否沉默，例如甲基化敏感长距离PCR （MS-LR-PCR）试剂盒来测量每个FMR1等位基因的甲基化分数。但仍需要一种全面、精准且高效的FXS基因检测手段。
 
单分子长读长测序在一次分析中，可准确分析FRM1基因中的CGG串联重复数量，识别AGG等插入中断，以及导致FMRP蛋白功能缺失的其他突变（SNV、InDel及微缺失）等，真正达到精准全面。
 
传动方法尚存局限
CGG重复扩增是神经元核内包涵体疾病和一系列临床表型的原因。CGG串联重复扩展难以被有效扩增和检测。目前，临床上常用于FRM1基因的CGG串联重复的的分子诊断的TP-PCR（三重复引物PCR）和Southern 印迹杂交等方法，存在设计及操作繁琐、有效率不高和通量低，并且不适合对多个基因区域进行并行分析的不足。
 
Southern 印迹杂交
被认为是检测大片段STR扩增的金标准，但这种方法耗时长、效率低、成本高昂、检测通量低，并且单次分析需要大量（高达10 μg）的高质量DNA。Southern 印迹杂交还无法检测分析较大的长片段的STR，参见图5；更加无法检测到SNV和InDel等致病突变 [12]。
 
三重复引物PCR （TP-PCR）
与Southern 印迹杂交相比，灵敏度更高，周转时间更短，通量更高，也更便宜。TP-PCR理论上可检测所有FMR1全突变，全突变病例无论包含多少个CGG重复数，TP-PCR扩增子峰将超过FXS的200个CGG重复的致病性阈值[13,14]。TP-PCR还可以对FMR1动态突变中的AGG中断模式进行表征, 但无法检测到新的插入中断类型，表征能力有效。由于特别的设计，在扩增的样品中，TP-PCR将产生高度异质的扩增子片段，这些片段在电泳时表现出特征性的“卡顿”模式，参见图5。但由于高度重复的区域被扩增，扩增产物片倾向于为较短的读段，使得难以准确确定扩展重复的真实长度，参见图5，导致有时会无法准确区分全突变（FM）和前突变（PM）类型[12]。此外，在具有高GC含量的大重复序列（GC含量高的区域导致的二级结构形成会对PCR扩增的效率产生显著影响）、重复的侧翼区域或侧翼变体中，开发出有效的PCR引物及体系都极具挑战性。目前，优化的TP-PCR方法可以检测多达900个六核苷酸重复的扩展重复大小，但仍旧无法准确确定更大的重复重复单元数[15]。此外，TP-PCR还无法同时评估FRM1基因中的致病SNV和InDel等其他变异。
 
二代测序（NGS）
虽然NGS在临床上使用越来越多，但短读长的NGS平台无法对大型和／或复杂的串联重复扩增进行准确分析，基本无法对FRM1中的CGG串联重复数进行有效检测分辨。首先，高度重复和／或富含GC的基因组区域对NGS文库制备、PCR扩增和测序均存在挑战，因此难以对许多STR区域进行足够深度的覆盖。其次，由于STR区域的重复性可能导致与参考基因组进行比对时，将reads进行错误的拼接和组装。更为根本的是，NGS技术的短读长度（~300bp）不足以跨越大的STR区域，因此无法精确确定其长度，参见图6。上述这些限制阻碍了NGS在STR导致的动态疾病临床诊断中的应用[12]。但NGS可以通过对FRM1基因的全长覆盖来检测致病的SNV、InDel等。
 
单分子长读长测序诊断优势显著（更准确，更全面）
单分子测序长读长测序技术无需引入额外的PCR扩增，因此不受高GC含量的影响。此外，与短读长NGS相比，长读长的单条reads可跨越大片段的串联重复扩增的整个区域，非常准确的计算出串联重复数，参见图6。基于单分子测序的长读长测序可有效读取整个串联重复区域的长度，并克服了使用短读长无法有效和准确识别串联重复单元数量或使用RP-PCR（如TP-PCR）和Southern 印迹需创建重复引物探针的传统局限和不足[12]。
可准确识别AGG等中断位点：研究表明，AGG中断对于携带60到84个CGG重复的女性影响深远，应向具有前突变的女性提供的更准确的风险评估，可指导最合适的生殖策略，如进行三代试管婴儿。但传统方法的局限阻碍了AGG的分析，而单分子长读长单分子测序可产生高质量的结果，并允许明确构建女性两条X染色体的重复结构[16]。将AGG分析纳入FMR1诊断检查可以准确评估携带前突变的母亲将全突变遗传给子代的风险，这极大地改善了携带前突变的女性的遗传咨询。单分子测序提供FMR1 CGG重复序列的直接读数，因此可以掌握完整的重复序列[17]。单分子测序进行的AGG分析产生了明确的结果，有助于确定具有突变前的女性的准确扩增风险，从而对遗传咨询产生积极影响。
 
可全面覆盖其他致病变异：值得注意的是，FMR1基因内单核苷酸变异（SNV）、短的插入或缺失（InDel）和微缺失，以及包含部分或整个FMR1基因座的大缺失也是5%左右的FXS的致病原因，而这些变异的检测由于需要结合多种不同的技术方法且成本高昂，长期以来没有有效的解决方法。而长读长测序在可有效检测FRM1的CGG串联重复时，也可同时全面覆盖上述这些致病变异，达到一网打尽的目的。总之，长读长测序能够快速且具有成本效益的方式准确分析短串联重复扩增，在包括FXS等串联重复动态突变疾病的诊断上优势显著，大有可为[18,19]。  
04FXS的治疗进展
治疗方法有限
目前尚无有效的治疗药物和疗法。其治疗主要是：早期干预，针对各种认知交流和行为损害可采用语言训练、认知训练、感觉统合训练、听觉统合训练、结构化的学习环境和行为管理等综合治疗。因男性的症状比较重，智力、行为方面的问题比较明显，强调要早发现、早治疗。特殊教育、行为疗法、药物治疗等有一定治疗效果，有助于改善患者行为能力，提高生活质量，可一定程度降低对患儿将来的生活和学习的影响。
 
基因疗法进展
基因疗法、基因再激活和蛋白替代疗法因可从源头上治疗脆性X综合征而被寄予厚望，目前这些疗法仍处于临床研究的早期阶段。
 
靶向治疗进展
针对FMRP蛋白的下游通路进行靶向干预，同样具有广阔的治疗前景。这些疗法涉及中枢神经系统的多种机制，靶点选择多样，包括突触生长因子、Sigma-1受体、大麻素受体、核糖体蛋白S6激酶1、血清素、钾离子通道等。同样，目前这些疗法仍处于临床研究的早期阶段。
 
一级预防至关重要
通过基因筛查确定携带者或患者，确诊后应对患者的一级亲属进行检查，检出前突变或全突变携带者，通过遗传咨询、产前诊断、三代试管婴儿技术等避免子代患病。
 
05小结与展望
脆性X综合征是是继唐氏综合征之后的第二大智力障碍的病因，也是导致智力障碍和自闭症等精神障碍最多的单基因疾病，目前在我国收到人们的关注和重视的程度上不及发达国家。对育龄妇女和新生儿进行FXS分子检测筛查，可以识别出FMR1扩增的异常，可能从诊断和测试后遗传咨询中获益。阻碍对FMR1扩增异常进行大规模筛查的一个重要因素是目前尚缺乏灵敏度高、通量高且具有成本效益的检测方法和产品。
 
针对串联重复扩增导致的疾病的临床诊断方法开发起来非常困难且耗时，且通常无法准确评估具有高GC含量的较长的STR区域。大片段的CGG串联重复通常难以被准确扩增和检测，超出了目前临床上常用的分子诊断技术的能力。
 
单分子长读长测序技术可对FMR1基因中CGG重复扩增、SNV、InDel及微缺失／缺失等平行分析，可以完整表征具有正常，前突变和全突变状态。当没有检测到典型的CGG重复扩增时，通过鉴定FMR1基因内的致病变异来完成突变测试。真正做到单次检测，一网打尽，而无需使用多种方法的组合才能完全覆盖可能导致FXS的变异。其检测效率和准确度度远优于传统FXS分子检测方法。还可实现筛诊一体，为FXS精准防控及遗传咨询提供了强有力工具，具有广阔的临床应用前景。
 
此外，诊断成本也是在临床实践中必须考虑的问题，目前，长读长测序方法的成本还相对较高，无法支持临床上的广泛应用，有待进一步降低成本，以便更广泛地应用在包括FXS等动态突变疾病的诊疗中来。
 
参考文献
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