今天跟大家分享一篇最新发表在science上的文章‘In vivo brain GPCR signaling elucidated by phosphoproteomics’，通讯作者是来自德国马克斯普朗克生物化学研究所的Matthias Mann教授。Matthias Mann教授是蛋白质组学研究领域的领军人物，其课题组一直致力于质谱技术的开发和在生物学研究领域的应用，例如我们熟知的组学定量方法SILAC以及MaxQuant系列算法等都是由其建立，并且通过与生物学家的广泛合作，该课题组利用先进的质谱技术先后在人类蛋白质组水平揭示了大量存在的磷酸化位点谱图、赖氨酸乙酰化位点谱图以及糖基化位点谱图等。

该篇science的工作也是该课题组发展的一种“高通量磷酸化蛋白质组学（EasyPhos）”技术的拓展应用。EasyPhos技术是Mann实验室于2015年开发的用于快速高通量定量磷酸化位点并实现深度覆盖的技术，例如可同时在96孔板中对不同种类的细胞或组织的磷酸化蛋白质组进行分析并鉴定到>10000个磷酸化位点。

传统的磷酸化蛋白质组学工作流程包括使用FASP（过滤辅助样品制备）或基于尿素的蛋白质酶解、肽段脱盐和悬干、肽分馏（fractionation）、IMAC或TiO 2富集磷酸肽以及LC-MS/MS技术鉴定，而EasyPhos技术优化了蛋白质酶解buffer，使其与磷酸肽段的富集兼容，从而省去了肽段脱盐和肽分馏的步骤，同时使该样品制备能在96孔板中进行，实现了高通量操作。

而该篇science工作利用EasyPhos技术，以阿片受体（一种G蛋白偶联受体）为模型，通过对小鼠大脑不同区域内50000个磷酸化位点的量化，深度解读了大脑内阿片受体被激动剂激活之后的信号通路变化。

G蛋白偶联受体（GPCR）超家族是神经疾病的主要药物靶标，但即使刺激单一的GPCR通常也会激活许多平行的信号通路，每个通路都会导致独特的药理结果，因此基于GPCR设计的激动剂药物都会或多或少的有些副作用。以kappa阿片受体（kappa opioid receptor，KOR）为例，KOR在中枢神经系统中广泛存在，且在不同的大脑区域表达量不同，激活后的生理效果也不一样。

现有的研究已经表明KOR激动剂药物激活KOR后，会引起膜电位超级化，使神经递质释放减少，阻断神经冲动的传递，因而该类药物具有很好的镇痛、抗惊厥等疗效。但不幸的是，该类药物会诱发焦虑、厌恶等副作用，对于副作用的机制至今没有很好的解释以及相应的治疗策略。该研究中，作者利用高通量磷酸化蛋白质组学对KOR激动剂诱导的信号通路进行了深度解析并找到了其诱导厌恶副作用的靶点。

首先作者用五种不同结构的KOR激动剂注射小鼠，于注射后5分钟和30分钟后，分别获取了大脑五个区域的组织（纹状体、海马、皮质、延髓和小脑，前四种组织不同程度表达KOR，最后一种组织不表达KOR），接着利用EasyPhos技术对五种组织的磷酸化蛋白质组进行了鉴定，实现了对6700个脑蛋白的50000个磷酸化位点的定量，并观察到不同的KOR激动剂对这些磷酸化位点的扰动程度是不一样的，且具有区域特异性和时间动态性。

其中激动剂 U-50,488H对这些磷酸化位点扰动最大，且主要集中在纹状体区域，例如注射U-50,488H激动剂5分钟后，纹状体即有1000个磷酸化位点发生变化，对这些磷酸化位点发生变化的蛋白进行GO生物功能分析发现主要在 “神经递质分泌” 和 “多巴胺能神经突触” 功能中有富集。鉴于副作用厌恶状态的出现是由于纹状体区域伏核（nucleus accumbens，NAc）内的棘突神经元被激活，因此作者接下来着重关注给予KOR激动剂处理后纹状体区域内突触蛋白磷酸化水平差异。作者通过对U-50,488H刺激5分钟后纹状体突触蛋白磷酸化水平的差异分析发现，突触蛋白被大规模去磷酸化，于是作者猜测U-50,488H可能特异性激活了Ser/Thr 磷酸酶系统。

为了验证这一假设，作者给小鼠注射了磷酸酶抑制剂，发现U-50,488H诱导的突触蛋白的广泛去磷酸化现象消失，证明了磷酸酶在突触GPCR信号转导中的重要性。更重要的是，作者通过对U-50,488H诱导的信号通路的变化分析发现，mTOR信号通路是排在首位的，被U-50,488H显著激活，而以往的研究也表明纹状体内mTOR信号通路功能障碍跟重度抑郁有关系。于是作者进一步猜测KOR激动剂U-50,488H诱导的厌恶副作用跟mTOR通路有关。

为了验证这一猜测，作者先给予小鼠mTOR信号通路抑制剂处理1h后再给予U-50,488H处理，小鼠动物模型的厌恶副作用消失，而其镇痛、抗惊厥的疗效不受影响。

该研究首次利用高通量磷酸化蛋白质组学深入解读大脑内GPCR信号转导通路，为治疗GPCR激动剂药物诱发的副作用以及未来开发更有效的GPCR药物提供研究策略。

文章引用：DOI: 10.1126/science.aao4927

文章链接：

http://science.sciencemag.org/content/360/6395/eaao4927.full