外泌体作为活细胞释放到细胞外基质中的膜性囊泡，携带蛋白质、核酸和脂类等多种生物活性分子，在细胞间进行物质交换和信息传递，在神经系统退行性疾病的发生、发展过程中具有重要作用。因此，外泌体在疾病的早期诊断和治疗上具有重要研究价值。

        近年来，神经退行性疾病（neurodegenerative disease，ND）的发病率和死亡率呈不断升高的趋势，它是一类起病隐匿的进展性疾病，其发病机制复杂，早期确诊困难，因此寻找有效的生物标志物在ND患者的早期诊断、临床治疗和预后监测的过程中发挥着至关重要的作用。随着对ND研究的不断深入，发现大脑中所有细胞（包括神经元、小胶质细胞和星形胶质细胞）分泌的外泌体，都在细胞通信中发挥关键作用，一方面，外泌体不仅在细胞内短距离传播信号，而且通过血脑屏障广泛传播到整个大脑。另一方面，外泌体进行细胞间通讯时可以携带神经退行性疾病中病理性错误折叠蛋白，从而加快疾病的进展。

        现对外泌体的一般特性、外泌体与神经系统退行性疾病相互关系及其对于神经退行性疾病诊断和治疗的应用价值进行概述。

一、外泌体概述

        1983年，Pan和Johnstone团队首次在绵羊网织红细胞成熟过程中，发现了一种与转铁蛋白释放到细胞外途径相关的小囊泡，并于1989年定义为外泌体（exosome）。最初，外泌体被认为是一种清除细胞代谢废物的运输工具，越来越多的研究表明，外泌体在细胞通讯过程中起重要作用，能够反映并影响细胞的生理、病理状态，其中某些分子成份与疾病的发生、发展、治疗有密切联系。

图2     外泌体

1.1 外泌体的释放

        细胞外囊泡根据其直径大小可分为三种，分别为凋亡小体(50～5000 nm)、微泡(100～1000 nm)、外泌体(30～150 nm)。外泌体与细胞凋亡过程中产生的小囊泡不同，外泌体只能由活细胞分泌，且能被体内多种类型细胞分泌，广泛存在于各种体液。外泌体通过胞吞-胞吐方式由亲本细胞释放；首先，胞膜内化形成胞内体，胞内体聚集形成多泡体(Mullivesicular Bodies, MVBs)，MVBs与亲本细胞膜融合，通过胞吐作用将外泌体排出细胞。

图3     外泌体的释放与通讯

        在释放到细胞外环境后，外泌体通过近分泌、旁分泌和内分泌等三种方式进行生物信息的交换和传递，在被受体细胞摄取后，其内载的DNA、mRNA、miRNA、蛋白质和脂质等组分通过改变转录和翻译程序影响蛋白质的修饰和定位，调节信号级联通路、关键酶反应等影响受体细胞的表型和功能。

1.2 外泌体的通讯作用

        外泌体与靶细胞交流通过以下方式：（1）外泌体膜与受体细胞膜相互融合，释放所携带物质进入受体细胞。（2）通过配体受体之间相互作用激活信号通路。（3）细胞通过胞吞作用将整个外泌体内化后，与溶酶体融合，将所携带物质释放入受体细胞。此外，内化后的外泌体还可以与MVBs融合，再次被分泌出细胞外。

1.3 外泌体的组成

        外泌体由构成性分子和运载分子共同组成，构成性分子取决于释放外泌体的亲本细胞种类，其外侧双层膜结构主要成分为脂质和蛋白质。外泌体的构成及运载分子包括RNA、脂质及蛋白质，其中蛋白质包括四次跨膜蛋白(CD9、CD63、CD81、CD82 )、Flotillin、Alix、TSG101和热休克蛋白(Hsc70、Hsp90)等，四次跨膜蛋白常被作为外泌体鉴定标志物。Flotillin主要用于膜蛋白之间的相互交流与信号转导，研究表明FlotiUin可作为阿尔兹海默病(Alzheimer disease, AD )诊断的新型标志物。外泌体还携带有mRNA、miRNA、IncRNA、circRNA，并转移至其它细胞中发挥生物学调控作用，成熟miRNA的一条单链可与某些蛋白质相互作用，形成RNA诱导沉默复合物(RISC)调节蛋白质表达。不同外泌体的运载分子不尽相同，这与外泌体亲本细胞和外泌体形成过程中各种生理和病理条件有关。

图4     外泌体的组成

二、外泌体与神经退行性疾病
2.1 外泌体与阿尔茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）

        AD的病理特征为β-淀粉样蛋白(Amyloid β-protein，Aβ)沉积形成神经炎性斑，及过度磷酸化Tau蛋白在神经元内形成神经原纤维缠结。AD患者的病理斑块中有大量的Aβ及外泌体特定标志蛋白Alix存在，Rajendran等发现Aβ可通过外泌体分泌至细胞外，并证实了外泌体具有在细胞间传播毒性Aβ和高磷酸化Tau蛋白的能力，当外泌体途径被阻断可减弱Aβ聚集和传播。有研究报告：小胶质细胞减少可以抑制Tau蛋白增殖，小胶质细胞外泌体合成受到抑制，可降低Tau蛋白的繁殖与传播，这说明小胶质细胞外泌体在AD的发生发展中同样具有重要研究价值。另有研究发现：轻度至重度的AD患者，脑脊液外泌体中磷酸化Tau蛋白浓度显著高于早期阶段，这表明外泌体相关的磷酸化Tau蛋白与疾病的进展有关。
图5      外泌体与阿尔茨海默病

2.2 外泌体与帕金森症（Parkinson′s disease，PD）

        帕金森病（Parkinson′s disease，PD），也常被称为“震颤麻痹”，是一种神经系统退行性疾病。这个疾病的主要原因是由于黑质多巴胺能神经元的退化和死亡，可能与遗传、环境因素及神经系统老化等多种因素有关。PD 是仅次于 AD 的第二大类神经系统退行性疾病，65岁以上人群发病率为2% 。其病理特征是α-突触核蛋白(α-synuclein, α-syn)构成的路易小体(Lewy Body，LB)在神经元胞体和轴突内沉积。目前认为神经元功能受损甚至死亡是由α-syn寡聚体引起的。

        α-syn是大脑中大量存在的一种可溶性蛋白质，尚不明确其健康状态下的功能，但错误折叠和纤维状聚集的α-syn沉积在中枢及周围神经系统中将导致一系列α-突触核蛋白病发生。

        α-syn可被分装入外泌体释放到细胞外环境，导致类似于朊病毒样的病理传播。实验发现，PD患者血清外泌体中α-syn含量多于正常对照组，且α-syn以寡聚体形式存在于血清外泌体中；但PD患者脑脊液总α-syn含量低于正常对照组，可能是中枢神经系统由于某种保护机制向血液系统中转运α-syn增加，其具体机制需进一步研究。将PD患者血清外泌体接种细胞，可致其表达α-syn单体及寡聚体增加；且用PD患者脑脊液外泌体接种健康小鼠，会使小鼠脑脊液中α-syn的表达水平呈剂量依赖型增加，故PD患者血清和脑脊液外泌体可以促进靶细胞中α-syn形成。依赖于完整的外泌体传播途径，与游离α-syn相比，外泌体中α-syn更容易被受体细胞内化，在神经系统传播中，毒性更大。

        外泌体形成和分泌过程受自噬—溶酶体途径(ALP)调节。ALP异常时，蛋白质清除能力下降，并影响PD及DLB的发生发展；ALP受损将导致细胞内α-syn寡聚体的清除效率降低，引起α-syn寡聚体向细胞外释放增加，导致外泌体中α-syn寡聚体在细胞间传播，加速疾病进展。

        小胶质细胞被认为是传播α-syn寡聚体导致PD进展的潜在载体。用α-syn处理BV-2小鼠小胶质细胞，发现α-syn可以诱导小胶质细胞分泌外泌体增加，将此外泌体与神经元细胞共培养可致神经元细胞凋亡增多，说明外泌体在小胶质细胞介导PD的进展过程中扮演重要角色。

2.3  外泌体与多发性硬化（multiple sclerosis，MS）

        多发性硬化(multiple sclerosis，MS)是一种病因未明的中枢神经系统炎性自身免疫性脱髓鞘疾病，主要累及脑、脊髓和视神经。其主要病理改变包括中枢神经系统白质脱髓鞘、炎性浸润和轴突破坏等。

        外泌体在多发性硬化的发生发展过程中起到重要作用。其在体内外均可促进免疫炎症因子的趋化和聚集。多发性硬化的特效药物可降低脑脊液中外泌体的数量，提示外泌体可以作为多发性硬化的标志物之一。炎症状态下，外泌体的表达增加，增强细胞内、外炎症介质（IL-1β、IL-6、COX2、iNOS等）的交换，炎症因子的释放，也促进免疫细胞的趋化，免疫细胞反过来增加含炎症因子的外泌体的释放，从正反两相促进疾病进程。

        研究提示外泌体在MS的病理生理和发病过程中起着关键作用。在MS患者的血清和脑脊液中外泌体含量明显升高，外周炎性细胞通过释放含有γ-干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)等炎性细胞因子的外泌体，进而损伤内皮细胞，破坏血脑屏障，介导MS发病。内皮细胞功能受损、血脑屏障通透性升高，进而使外周激活的淋巴细胞更易经损伤的BBB进入中枢神经系统，继发脱髓鞘、轴突破坏等一系列典型病理损伤。另一方面，这些囊泡中表达的炎性细胞因子打破Th17和TregT细胞之间的平衡，促进疾病进展。

        MS至今尚无高度特异的生物学标记物。近年的研究表明，MS患者的血清和脑脊液中所含外泌体可以作为一种诊断标志物。Welton等指出在MS患者的血清中提取的外泌体中含有50多种蛋白质，且有30种已被报道与MS的疾病进展有关。研究进一步发现，外泌体不仅可早期诊断MS，更可以区别MS亚型。在不同亚型的MS患者分离的外泌体含有不同的miRNA，揭示了外泌体的检测可以作为一个更简便更有效的诊断手段。

2.4 外泌体与其他退行性疾病

        肌萎缩侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）是一种进展迅速的神经退行性疾病，以运动神经元丢失、随意肌麻痹等为特征。在ALS患者的细胞外泌体中发现了错误折叠的蛋白质，如mSOD1、FUS、TDP43和C9orf72扩张DPRS等神经毒性成分。

        视神经脊髓炎（neuromyelitis optica，NMO）是视神经与脊髓同时或相继受累的急性或亚急性脱髓鞘病变。通过对NMO患者的脑脊液分离出的外泌体的蛋白组学分析发现，外泌体内含的NMO标志性蛋白（例如胶质细胞纤维原酸性蛋白GFAP）的表达有特异性的增加，结果与流式细胞术相一致。与此同时，MS、特发性纵横肌炎（I-LETM）的特异性标志物也有相应表达。提示我们可以将脑脊液外泌体分析作为神经系统免疫疾病鉴别诊断的手段之一。

        这些研究和结果为外泌体诊断和治疗神经退行性疾病提供了有力的证据，但还需要深入研究这类疾病的机制，并将这一知识转化为临床中的应用，从而为疾病治疗带来希望。

三、外泌体在神经系统退行性疾病的应用价值

        外泌体存在于各种体液中，便于获得，其成分特异，所携带物质不仅能反映亲本细胞的生理和病理状态，并且外泌体可保护其携带的miRNA、蛋白质等稳定存在，不被核酸酶和蛋白酶降解，因此，可成为神经系统退行性疾病的诊断重要标志物；因其具有穿过血脑屏障的功能，对其进行修饰、装载，将成为药物治疗的载体，可在神经系统退行性疾病的治疗中发挥重要的作用。

3.1 外泌体与神经系统退行性疾病的诊断

        神经系统退行性疾病起病隐匿，早期无明显临床症状，但生物特性的变化已经在外泌体中体现，因此，外泌体的改变可为疾病早期诊断提供依据。目前PD的诊断多依赖于临床症状，但当纹状体中70%至80%和黑质中50%的多巴胺能神经元丢失时才出现运动症状，因此，PD早期诊断的生物学标志物有待进一步明确，人们正在尝试从脑脊液、血液、尿液中提取外泌体及外泌体携带物质进行PD早期诊断的探索。

        与脑脊液相比，血液和尿液样本更易获得，但外周血中血小板和红细胞会产生大量的α-syn，若制备样本时发生溶血则影响血浆外泌体中α-syn检测结果。在PD患者尿液外泌体中可检测到与PD相关的LRRK2蛋白，但由于LRRK2在人体内表达多变，不能得到稳定的检测结果，因此不能用于PD的早期诊断。DJ-1是一种由189个氨基酸构成的蛋白质，具有抑制α-syn聚集的作用，有研究发现男性PD患者尿液外泌体中DJ-1与正常人存在明显差异，但研究样本量较小，能否成为未来诊断标志物仍需进一步验证。

        脑脊液可直接反映脑内病理变化，故使用脑脊液外泌体样本对疾病诊断更精确，但不易获得。对脑脊液外泌体miRNA分析发现PD患者脑脊液外泌体较正常对照组有16个miRNA表达上调，11个miRNA表达显著下调，而miR-153、miR409-3p、miR-10a-5p显著过度表达，这些差异有望成为PD早期诊断标志物。

         Aβ在脑内沉积是一个长期缓慢过程，对AD临床前期诊断有助于早期干预疾病发生发展。研究表明AD患者血浆脑源性外泌体中总Tau蛋白、P-T181-tau、P-S396-tau和Aβ-142水平均显著高于正常对照组，在认知正常的高危患者中可检测到磷酸化Tau蛋白、P-S396-tau和P-T181-tau，这些改变可追溯到AD诊断的10年前。动态检测发现，从临床前的高危人群到AD确诊，患者血浆外泌体Aβ1-42水平由逐渐升高到显著增高，因此，血浆外泌体Aβ1-42具有刻画AD进展的价值。

        外泌体的标志蛋白Flotillin是位于外泌体脂筏上的疏水性蛋白，可通过影响Ca²⁺稳态、线粒体功能参与AD的发病。一项临床研究发现：与非AD人群相比，AD患者脑脊液和血清中Flotillin水平显著下降，用正电子发射断层摄影(PET)成像技术分析Aβ沉积，发现血清Flotillin水平与Aβ沉积负相关，这表明血清Flotillin 水平可用来评估Aβ沉积，可用于早期诊断。

3.2 外泌体与神经系统退行性疾病的治疗

        外泌体经改造后可回输至自体，减少因药物载体带来的免疫反应，提高治疗的安全性，且由于其能够通过血脑屏障，故可用外泌体作为药物载体对神经系统退行性疾病进行靶向治疗。中国研究团队通过饱和溶液孵育法，成功有效的将多巴胺装载入血浆外泌体中，通过动物实验证实，装载入血浆外泌体的多巴胺透过血脑屏障，被成功传送至大脑的黑质和纹状体，且多巴胺在脑内分布增加了15倍以上。有研究团队将过氧化氢酶(强效抗氧化剂)在不改变外泌体结构的情况下装载入外泌体，携带过氧化氢酶的外泌体透过血脑屏障，富集在神经元细胞和小胶质细胞，发挥强大的保护作用。上述的研究结果将为PD、AD及其他神经系统退行性疾病的治疗提供新的方法。

四、小结

        随着人口老龄化加剧，神经系统退行性疾病发病率越来越高，给患者、家庭及社会带来巨大影响，探究其病理，对其进行早期诊断、早期干预成为当下解决问题的重点。

近年来学术领域对外泌体的结构和功能等的研究有了重大突破，已有多项研究证实外泌体在ND病理和治疗过程中发挥关键作用，外泌体自身的优越性使其成为细胞间通讯的重要媒介，在调节正常生命活动和疾病的诊断和治疗中能发挥独特的生物学功能。作为当前的研究热点，外泌体受到了国内外研究者的广泛关注。对外泌体进行探索发现其与神经系统退行性疾病有巨大联系，虽然目前仅在研究阶段，实际应用还面临诸多困难，但其仍不失为一种有前途的方法。

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