植物来源的类外泌体纳米囊泡的研究进展与展望
2025-04-23 来源: 点击次数:90外泌体是一种小的细胞外囊泡，大小从30～150纳米不等，可以来源于各种类型的细胞。近年来，哺乳动物来源的外泌体被广泛研究，并发现在调节细胞间通信中发挥关键作用，从而影响多种疾病的发展和进展。数千年来，传统中医一直在使用植物性药物，越来越多的证据表明，植物来源的外泌体样纳米囊泡（植物外泌体）在结构和功能上与哺乳动物来源的外泌体有相似之处。在这篇综述中，概述了植物外泌体研究的最新进展及其对人类健康的潜在影响。具体来说，总结了在呼吸、消化、循环和其他疾病中的作用。植物外泌体作为一个有前途的研究领域的潜力，对人类疾病的治疗具有广泛的意义。我们将持续探索植物外泌体对人类健康的影响。
然而，外泌体存在局限性，包括同时含有免疫激活剂和免疫抑制因子，可能会降低宿主对病原体的抵抗力，以及提取难度高、纯度低，这大大增加了外泌体生产成本。通过改进提取工艺和扩展可用性来克服这些限制来源是必要的，这导致了植物来源的外泌体样纳米囊泡（PELNs）的发现。根据目前的研究，植物细胞外囊泡的生物发生有三种可能的途径：外囊阳性细胞器（EXPO）途径、多泡体（MVBs）途径和液泡途径。其中，MVBs途径被认为是PELNs形成的主要途径。基本过程包括质膜向内出芽以形成早期内体，这些内体成熟并与反式高尔基体网络通信，形成MVBs。MVBs内的腔内囊泡（ILV）可以包含各种物质，如RNA、DNA、脂质等。MVBs与质膜融合后，ILV可释放到细胞外间隙，形成PELNs。该途径与已知的哺乳动物来源外泌体（MDEs）的生物发生途径高度相似。EXPO途径涉及形成类似于自噬体的双膜结构，它可以与质膜融合，向细胞壁释放单膜囊泡。液泡途径主要发生在植物防御真菌病原体期间。感染后，液泡与质膜融合并释放其水解酶和防御蛋白的内容以抵消病原体的入侵。已经发现，从植物中提取的PELNs，如生姜、人参、小麦、红景天、甘草等，不仅具有与MDEs相似的抗纤维化、抗病毒、抗肿瘤作用，而且还弥补了它们的不足，如部分免疫原性和有限来源。因此，PELNs具有很大的研究价值。
本文整理和总结了当前关于PELNs的研究，分析了PELNs的分离、纯化、鉴定和功能。主要强调的是它们对临床疾病的治疗潜力，根据人体解剖系统进行分类。目标是为PELNs在临床疾病治疗中的未来利用提供综合资源，同时也提出新的概念和研究方法，以促进对PELNs的进一步研究。
1.1 PELNs的提取
图2 不同植物外泌体提取方法的原理、优缺点
PELNs具有产量高、易于获取等优点。然而，目前对PELNs提取和纯化的研究大大落后于MDEs。分离和纯化PELNs的可用方法相对有限，主要基于用于MDEs的成熟技术。虽然MDEs通常从生物体液中分离出来，但PELNs是从质外体清洗液中分离出来的，差速离心仍然是两者的基本提取方法。然而，由于植物和动物之间的生理差异，通过这种方法获得的PELNs通常与蛋白质、核酸聚集体和其他囊泡混合。因此，必须使用密度梯度超速离心法进行进一步纯化以分离污染物。植物汁液中存在高分子量成分，如纤维素和淀粉，通常会导致离心困难。为了提高分离效率并解决传统离心技术的某些局限性，研究人员提出了各种离心方法的组合。一种广泛使用的方法将差速离心与蔗糖密度梯度离心相结合。这种方法因其易用性、经济性和实现高提取纯度的能力而广受欢迎。按照这种方法，细胞外囊泡通常位于30%～45%蔗糖溶液的中间层，如图3所示。
图3 植物来源的类外泌体纳米囊泡（PELNs）提取方法：超速离心结合蔗糖密度梯度离心
测量PELNs尺寸和表面电荷的最常用方法是动态光散射（DLS）和纳米颗粒跟踪分析（NTA）。DLS由于其分辨率低和无法测量颗粒浓度等局限性，已逐渐被NTA取代。NTA捕获10～2000nm尺寸范围内细胞外囊泡的布朗运动，并使用爱因斯坦方程计算它们的浓度和流体动力学直径。它提供比DLS更高的分辨率，并且不易受到较大颗粒强烈散射的干扰，从而获得更稳定的结果。因此，它已成为表征PELNs尺寸的首选技术。目前已知的PELNs尺寸范围在50～500nm之间，表面电荷范围为中性至−50mV。然而，当应用于PELNs检测时，PELNs的不当提取会引入来自细胞碎片、脂质囊泡、胶体颗粒、蛋白质聚集体和样品中其他杂质的污染，不可避免地影响NTA分析的结果。此外，近年来，学者们发现局部表面等离子体共振（LSPR）技术在用于外泌体检测时表现出高灵敏度。此外，基于AFM和LSPR的细胞外囊泡表征技术在液体活检中的应用正在得到广泛研究。
图4 植物来源的类外泌体纳米囊泡（PELNs）的生物发生、形态结构和组成
PELNs的形态和结构特征如图4所示。与MDEs类似，PELNs的膜由磷脂双层组成。然而，PELNs表现出不同的脂质特性，例如高浓度的磷脂酸、磷脂酰胆碱、二乳糖基二酰基甘油和单半乳糖基二酰基甘油，这与MDEs不同。这些独特的脂质组成赋予PELNs固有的细胞调节特性。PELNs中的蛋白质浓度通常很低，并且这些蛋白质中的大多数是胞质蛋白，包括肌动蛋白、蛋白酶和膜蛋白，它们在膜内充当通道和转运蛋白。此外，外泌体上表面标志蛋白的存在在其鉴定、表征和特异性抗原抗体反应中起着至关重要的作用。例如，CD81、CD9、CD63、TSG101和flotillin是广泛认可的MDEs表面标志蛋白。然而，PELNs表面标志蛋白的鉴定仍然难以捉摸。尽管研究在包括葡萄柚在内的各种植物中发现了几种高丰度的蛋白质，如髌蛋白-3、热休克蛋白（HSP）、水通道蛋白（AQP）、网格蛋白重链（Chc）和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH），但它们的同源物已在MDEs中报道。值得注意的是，最近的研究表明，合成蛋白PEN1、ABC转运蛋白PEN3和跨膜四蛋白-8可能是PELNs的候选表面标志蛋白。已在拟南芥中鉴定出PEN1，其在PELNs中的富集已通过Westernblot分析得到证实。已在拟南芥中检测到PEN3，但尚未通过Westernblot确认。TET3是CD63的同源物，在PELNs中高度富集。然而，由于实验数据有限，这种观点尚未被广泛接受，有待进一步研究验证。PELNs中的核酸包括DNA和各种RNA，其中microRNA（miRNA）是一种长度为22个核苷酸的小RNA分子，缺乏编码特性。miRNA通常调节信使RNA（mRNA）翻译或切割mRNA以调节基因表达，或诱导特异性靶基因表达。
正是由于存在多种蛋白质、脂质、DNA和各种复合RNA，因此PELNs具有重要的特性，可以参与细胞之间的信息传递和材料交换，并且有许多研究将这些特性应用于人类疾病的治疗（图5），我们将在下面详细讨论。
图5 植物来源的类外泌体纳米囊泡（PELNs）的生物学功能
2.1 PELNs在消化系统疾病中的作用
例如，已发现生姜衍生的ELNs（GELNs）可以改变微生物组的组成并对宿主生理学产生积极影响。事实上，口服GELNs可以减少急性结肠炎，增加肠道修复和预防慢性结肠炎。最近的另一项研究表明，来自茶叶的ELNs可有效预防和治疗小鼠的炎症性肠病（IBD）。治疗效果归因于促炎细胞因子的下调、氧化应激的减少和肠道微生物群稳态的维持。同样，葡萄衍生的ELNs被证明可以通过Wnt/β-catenin信号通路预防DSS诱导的小鼠结肠炎。来源于西兰花的纳米颗粒也被发现可以激活树突状细胞AMP活化蛋白激酶并保护小鼠免受结肠炎。此外，Zhuang等人的一项研究发现，GELNs通过调节TLR4/TRIF通路激活核因子红细胞2相关因子2（Nrf2），防止酒精诱导的肝损伤。
PELNs对消化系统肿瘤也有治疗作用。例如，生姜衍生的ELNs通过降低炎性细胞因子和细胞周期蛋白D1 mRNA水平以及抑制小鼠肠上皮细胞增殖，在治疗结肠炎相关癌症（CAC）方面显示出有希望的结果。源自茶叶的ELNs也具有类似的功能。芦笋柯钦衍生的ELNs也被发现在体外和体内抑制肝细胞癌细胞增殖。此外，柑橘柠檬衍生的ELNs还通过增加促凋亡基因的表达和降低抗凋亡基因的表达，通过激活肿瘤坏死因子相关凋亡配体（TRAIL）介导的细胞凋亡来刺激癌细胞死亡，并减少促血管生成因子，如VEGF-A、IL-6和IL-8来抑制肿瘤生长。蛋白质组学分析进一步表明，柑橘柠檬衍生的ELNs主要通过诱导乙酰辅酶A羧化酶α（ACACA）下调来发挥其抗肿瘤作用。
图6 植物来源的类外泌体纳米囊泡（PELNs）用作药物递送的载体
细胞外囊泡由于其高稳定性和安全性以及穿越生物屏障的能力，最近成为一种很有前途的药物递送载体。PELNs特别有利，因为它们是具有固有安全性、无毒和低免疫原性的天然产物（图6）。对于炎症性肠病，载有siRNA的生姜衍生纳米脂质可有效递送siRNA药物以治疗溃疡性结肠炎患者。封装在生姜衍生的口服纳米脂质载体中的siRNA-CD98可以有效地靶向结肠组织并抑制CD98表达，从而减少常规合成纳米颗粒对结肠疾病的副作用，同时提高特异性。同样，已发现葡萄柚衍生的ELNs可将抗炎药物甲氨蝶呤（MTX）递送到炎症部位。这种方法抑制促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6的产生，同时增加血红素加氧酶-1和IL-10等抗炎因子的表达，从而提高对DSS诱导的小鼠结肠炎的治疗效果。对于消化系统肿瘤，葡萄柚衍生的脂质转化为纳米载体（GNVs）已用于治疗肺、结肠和乳腺肿瘤。GNVs与叶酸（GNV-FA）相结合显著增强了它们对肿瘤的靶向性，而将抗肿瘤药物紫杉醇（PTX）封装在GNV-FA上允许对结肠癌进行更特异性的治疗。还发现携带miR-18a的GNVs通过诱导IL-12表达和激活NK细胞和NKT细胞来抑制结肠癌的肝转移。
除了对胃肠道的保护和治疗作用外，还发现PELNs与牙龈卟啉单胞菌上的蛋白质特异性结合，从而降低细菌侵入人体的能力。这应用在治疗慢性牙周炎方面具有潜在价值。此外，从柠檬中提取的ELNs已被证明可以提高鼠李糖乳杆菌GG和嗜热链球菌ST-21的耐受性，有效抑制艰难梭菌的感染。大蒜衍生的ELNs能够与HepG2细胞上的配体结合并被内化，从而抑制炎症反应。香菇衍生的ELNs已被发现抑制NLRP3活化抑制IL-6的产生，同时通过降低IL1b基因的蛋白质和mRNA含量来抑制其活性，从而防止GalN/LPS诱导的急性肝损伤。
综上所述，上述研究证明了PELNs不仅在治疗消化系统疾病方面的潜力，而且在治疗肿瘤方面也具有潜力。尽管大多数研究仍处于实验室阶段，需要进一步的临床试验，但这些发现在未来发展和临床转化价值方面具有巨大的潜力。
此外，植物外泌体还有望用于治疗肺纤维化，肺纤维化是一种以细胞增殖、细胞外基质聚集和炎症损伤为特征的疾病，可导致肺功能的进行性下降。近年来的研究表明，来源红景天和蒙古蒿汤剂的植物外泌体，在体内外疾病模型中均表现出抗纤维化和抗炎作用，显著改善小鼠肺纤维化和肺部炎症。然而，这些作用的潜在机制尚不清楚，需要进一步的研究来阐明植物外泌体在这些疾病中的作用。
总之，PELNs在治疗呼吸系统疾病（包括 COVID19 和肺纤维化）方面表现出巨大的潜力。这些发现强调了进一步探索PELNs治疗应用的重要性，尤其是在呼吸系统疾病带来的持续全球健康挑战的背景下。
植物外泌体已被证明可以通过受体介导的细胞运输和膜融合跨越各种生理屏障，包括血脑屏障。在一项研究中，从葡萄柚中提取的ELNs与抗肿瘤药物阿霉素一起装载到基于肝素的纳米颗粒上，用于治疗胶质瘤。结果表明，这些葡萄柚来源的ELNs可以有效地绕过血脑屏障，准确地将阿霉素转运到肿瘤部位，从而改善抗胶质瘤的效果。葡萄柚ELNs也被发现携带miR17，并通过鼻内途径抑制脑肿瘤的进展。
此外，有报道称从人参根中提取的外泌体可以通过PI3K信号通路刺激骨髓间充质干细胞的神经分化。这一发现表明，植物外泌体可能在神经系统的再生医学中具有巨大的潜力。
总体而言，PELN 代表了治疗神经胶质瘤等神经系统疾病的一条有前途的新途径。为了充分了解潜在机制并评估这些结果的临床潜力，需要进行更多的研究。
研究表明，植物外泌体具有心脏保护作用。Liu等在一项研究中发现，人参根来源的外泌体可以通过保护线粒体凋亡途径来减轻阿霉素诱导的H9C2心肌细胞损伤。植物外泌体的抗氧化作用也可以用来保护血管系统。例如，蓝莓衍生的ELNs（B-ELNs）被发现通过调节TNF-α诱导的基因表达，减少活性氧（ROS）的产生和细胞活力的丧失，来防止各种应激源对血管系统的损伤。此外，B-ELNs可以作为生物活性化合物的创新候选治疗载体。从油菜中分离纯化的ELNs。草莓汁和柠檬在体外被脂肪间充质干细胞（ADMSCs）吸收后，具有显著的抗氧化作用，从而促进了心脏保护作用。草莓衍生的ELNs含有大量的维生素C，据推测对氧化应激有保护作用。同时，从柠檬中提取的ELNs也被携带足够数量的柠檬酸盐和维生素C，在体外被MSC摄取后也显示出显著的抗氧化作用。
虽然这些研究为 PELNs 治疗循环系统疾病的潜力提供了有价值的见解，但仍然缺乏临床研究。在这些发现可以有效地应用于临床之前，还需要进一步的研究。
Kumar等人最近的研究表明，GELNs影响芳基烃受体（AhR）的表达，AhR是一种配体激活的转录因子，调节体内的各种转录过程，包括葡萄糖代谢。AhR的过表达已经被证明会导致胰岛素抵抗，而没有AhR的小鼠则表现出更好的胰岛素敏感性和葡萄糖耐量。研究小组发现GELNs诱导miR-375的表达，从而抑制AhR的表达。这导致了在小鼠之间的葡萄糖耐量和胰岛素抵抗的显著改善。同样，从水稻糊粉蛋白细胞中提取的hvuMIR168-3p有助于人类细胞中葡萄糖转运体1（SLC2A1）的表达上调，导致血糖水平降低。其作用的机制可能与hvu-MIR168-3p沉默线粒体电子传递链复合物I基因有关。此外，hvu-MIR168-3p可下调动物体内的低密度脂蛋白受体配体蛋白1（LDLRAP1），提高动物血液中的LDL水平。随后的研究也表明，MIR168a的常见变异对LDLRAP1表现出不同的沉默作用。对从橙汁（ONVs）中提取的纳米囊泡的治疗潜力的研究已经报道了积极的结果。ONVs逆转肥胖小鼠肠道变化，增加肠绒毛的大小，同时降低甘油三酯含量。ONVs调节几种mRNAs的表达水平，其中一些参与免疫反应、脂肪吸收和乳糜泻释放。因此，ONVs可能有效预防或抑制由高脂、高糖饮食引起的与肥胖相关的胃肠道炎症。其他研究已经探索了用纳米颗粒包裹的植物提取物用于治疗目的。例如，来自紫檀芪的纳米颗粒制剂已被发现可以通过注射在糖尿病大鼠模型中降低血糖水平。同样，用改良的乳液-扩散-蒸发法制备的姜黄素纳米颗粒成功地降低了糖尿病大鼠模型中的空腹血糖和糖化血红蛋白水平。最后，姜黄素纳米颗粒和陈年大蒜提取物悬液在治疗糖尿病心肌病、减少炎症、心肌纤维化和心血管事件风险方面显示出了希望。我们预计未来植物外泌体在内分泌系统疾病治疗中有更多的应用。
在另一项研究中，研究人员从辣木种子中分离出MELNs，并检测了它们治疗人类急性淋巴母细胞白血病细胞和宫颈腺癌细胞的潜力。结果表明，MELNs可以抑制B细胞淋巴瘤-2（BCL-2）的表达，降低细胞内线粒体膜电位，从而抑制两种肿瘤细胞的增殖。本研究为子宫颈癌和白血病的治疗提供了一种很有前途的新方法。
总体而言，这些研究强调了 PELNs 及其 miRNA 含量作为癌症治疗策略的潜力。需要进行后续研究以优化这些分子的递送方式，以实现最佳治疗效果。
总体而言，PELNs为探索针对各种医疗条件的新治疗方法提供了一条令人兴奋的途径。它们的风险较小，不会造成与干细胞移植相关的伦理问题，并且可以直接输送到患处或静脉注射以达到全身效果。通过持续的研究，我们可能会在未来发现这些有前途的生物活性物质的更广泛应用。
PELNs的特性：不同的PELNs表现出不同的特性，例如大小、电荷和稳定性的变化。这些特性不可避免地对药物加载到PELNs中的负载产生重大影响。通常，较小的囊泡具有较大的药物载样量，因为它们的表面积与体积比较高。它们还表现出更快的释放速率和更高的稳定性。然而，过大和过小的囊泡都会影响载药效率。因此，有必要开发生产大小均匀的细胞外囊泡的方法。幸运的是，研究人员已经成功地采用了Bligh和Dyer技术（一种液-液萃取方法）从PELNs中提取均匀大小的纳米脂质，这些脂质作为更高效药物递送的载体。由于磷酸盐的存在，PELNs通常带有负电荷。在静电吸引的影响下，带正电荷的分子被这些带负电荷或中性电荷的PELNs更有效地吸收和封装。这为使用PELNs的载药开辟了新的研究方向，其中可以通过改变囊泡和目标分子携带的电荷来提高PELNs的载药效率。
载药方法：目前，常用的载药方法可分为被动负荷和主动负荷。被动加载涉及在特定温度下将PELNs与药物分子共孵育，依靠药物分子和囊泡之间的扩散和亲脂性相互作用进行结合。这种方法相对简单，但包封效率可能较低。主动加载方法包括超声辅助加载、电穿孔、挤出、和冻融循环。据报道，主动加载方法可以增加PELNs的加载能力增长了11倍以上。
外泌体修饰技术：可以通过将特定的生物活性分子固定在外泌体表面来增强外泌体递送药物的能力。例如，表面工程技术可用于用箭头pRNA-3WJ和FA修饰生姜衍生的外泌体，从而增强它们将基因递送到肿瘤部位的能力。同样，将聚乙烯亚胺与葡萄柚衍生的外泌体杂交也可以增加它们对脑肿瘤的基因递送能力。
给药途径：外泌体的给药途径包括口服、静脉注射、鼻内给药、局部注射等目前，PELNs给药最常用的途径是口服给药，具有方便、易于被患者接受等优点，特别适用于胃肠道疾病的治疗。但是，这种途径存在吸收慢、接受后载药量减少等缺点肝脏中的首过代谢。气管输送和静脉注射等肠外给药途径可以避免上述问题，但存在呼吸道刺激或痉挛的风险以及严重的药物不良反应。因此，每种给药途径都有其独特的优势和适用性，应根据不同的疾病和药物选择合适的给药途径。除了这些因素外，PELNs的载药效率还受外泌体类型、药物特性以及PELNs与药物之间的相互作用等因素的影响。然而，目前该领域的研究有限，需要进一步研究。
尽管PELNs具有许多有利的生物学和物理特性，引起了研究人员越来越多的关注，但目前的研究仍然存在一定的局限性和争议性问题。有鉴于此，我们总结了这些挑战和争议，并对未来的研究方向提出了建议，旨在为进一步研究PELNs提供指导。
与合成纳米颗粒相比，天然PELNs在生物相容性、稳定性、体内分布、延长半衰期和细胞内化方面具有更显著的优势。由于它们可以根据需要加载不同类型的物质，包括小分子、核酸和重组蛋白，因此有望成为一种极具成本效益的药物递送平台。
PELNs可以从丰富的植物资源中大规模生产。
参考文献：
【1】Mu N, Li J, Zeng L. Plant-derived exosome-like nanovesicles: current progress and prospects. Int J Nanomedicine. 2023;18:4987–5009.关于纳米颗粒跟踪分析仪LighTracker
