结直肠癌（CRC）是成本最高的健康问题之一，在发达国家癌症相关死亡率中排名第二。转移性 CRC 的预后较差，5 年生存率低于 15%。因此，发现能够实现 CRC 早期诊断、准确预后和个性化治疗的分子标志物极为重要，这仍是该领域的一项挑战。许多蛋白质已被确定为具有临床价值的潜在生物标志物，它们几乎是所有细胞功能的直接执行者。此外，蛋白质的显著多样性因众多翻译后修饰（PTM）而增加，这些修饰可以快速、可逆地响应环境或细胞内刺激，最终将成为有价值的生物标志物候选资源。目前，基于质谱的蛋白质组学能够同时检测数千种蛋白质及其表达变化，从而在疾病等特定条件下提供蛋白质组多样性的全局图景。

结直肠癌发展过程

PTM 是对特定氨基酸的化学修饰，可调节大多数真核蛋白质的构象、活性、相互作用、稳定性和空间分布，从而作为快速且可逆的开关，以一种非常 “经济高效” 的方式执行调节功能。磷酸化作为细胞周期、生长、凋亡和信号转导途径的主要调节因子就是一个例证。越来越多的证据表明，异常的 PTM 事件与多种人类疾病有关。事实上，磷酸化、糖基化、乙酰化、泛素化、甲基化和瓜氨酸化等 PTM 已被证明在 CRC 的发生、发展和转移中发挥作用，因此强调了对 PTM 进行全局分析以发现具有生物学和治疗潜力的靶点的必要性。

Summary of important PTM events and their involved pathways in CRC

由于蛋白质组中的大多数 PTM 丰度较低且亚化学计量，在没有预先富集的情况下，无法有效检测或定量测量。一般来说，用于全局 PTM 分析方法的富集技术根据所涉及的化学原理可分为两类：共价标记以及感兴趣的 PTM 与其选择性探针之间的非共价相互作用。针对每种类型的 PTM，已经开发了基于这两种化学类型之一的不同富集策略。随后，对富集的 PTM 进行蛋白质组学分析，可以使用质谱（MS）解析母离子的特定质量位移和子离子的质量特征。

磷酸化

蛋白质磷酸化通常发生在丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基上，是最常见的 PTM 之一，通常作为众多蛋白质功能的分子开关，负责信号通路的许多关键功能。在 CRC 中，大量异常磷酸化与细胞周期依赖性激酶家族蛋白、凋亡调节蛋白、生长因子受体及其下游信号分子密切相关。因此，驱动 CRC 肿瘤发生和发展的磷酸化蛋白质是用于早期诊断、化疗耐药和个体化治疗的有价值的生物标志物。传统的基于抗体的方法，如蛋白质免疫印迹（western blotting）、酶联免疫吸附测定（ELISA）和免疫组织化学，旨在检测单个磷酸化蛋白质，但无法对蛋白质磷酸化进行全局分析或识别磷酸化位点。在基于 MS 的蛋白质组学时代，磷酸肽富集和数据采集方面的方法学成果不断取得进展，使得对参与肿瘤发生和 CRC 发展的复杂信号通路进行磷酸化蛋白质组分析成为可能。

由于磷酸化蛋白质的亚化学计量和低丰度，在质谱分析之前，需要对磷酸化肽进行富集和分离。常用的富集方法包括金属氧化物亲和色谱（MOAC）、固定化金属离子亲和色谱（IMAC）、免疫亲和富集和基于结构域的富集。MOAC 和 IMAC 常用于丝氨酸 / 苏氨酸磷酸化的富集。SIMAC（IMAC 和 MAOC 的组合）进一步提高了磷酸肽的富集效率，能够对微量样品中的全局磷酸化蛋白质进行深入分析。由于酪氨酸磷酸化肽约占磷酸肽的 1%，IMAC 和 MOAC 等方法对酪氨酸磷酸化肽的富集效果不佳。相反，一种基于抗体免疫亲和的策略已经被开发出来，能够特异性富集酪氨酸磷酸化肽。此外，受体酪氨酸激酶（RTK）的底物，如 SH2 结构域，也可用于富集含有 SH2 相互作用结构域的酪氨酸磷酸肽。除了在富集技术上的努力，许多研究还致力于在质谱分析之前通过进一步分离来降低富集的磷酸肽的复杂性。常见的分离策略包括强阳离子交换色谱（SCX）、强阴离子交换色谱（SAX）、亲水相互作用液相色谱（HILIC）和静电排斥亲水相互作用色谱（ERLIC）。SCX 和 SAX 均基于磷酸肽的电荷分离，而 HILIC 根据磷酸肽的亲水性进行分离。ERLIC 通过亲水相互作用和静电排斥将磷酸化肽与非磷酸化肽分离。随后，富集的磷酸肽可以通过质谱结合成熟的同位素标记技术（如 SILAC、iTRAQ 和 TMT）进行鉴定或定量

Schematic process for phosphopeptides enrichment and subsequent fractionation in MS-based phosphoproteomic analysis

特定信号分子的磷酸化网络是 CRC 复发和转移的有价值的生物标志物。基于磷酸化蛋白质组生物标志物的复发风险分层有助于在辅助化疗中进行减法操作，以减少毒副作用和第二原发性肿瘤的风险。临床数据证实，低风险的 II 期 CRC 患者无法从辅助化疗中获益，而在低风险的 III 期 CRC 患者中，3 个月的辅助化疗并不逊色于 6 个月的辅助化疗。比较磷酸化蛋白质组学研究表明，SW480 细胞中细胞周期蛋白依赖性激酶 2（CDK2）在 Tyr15 位点的磷酸化水平比 SW620 细胞高 3.3 倍。因此，临床患者队列数据显示，CDK2 在 Tyr15 位点的磷酸化是低复发风险的生物标志物。在不久的将来，Tyr15 位点磷酸化 CDK2 水平较高的 II 期 CRC 患者可能无需辅助化疗即可安全管理。手术切除是治疗肝转移最有效的根治性治疗方法，估计 5 年生存率为 50%；然而，只有约 25% 的患者符合手术切除条件。转移的早期诊断可以提高转移性 CRC 的根治性（R0）切除率和预后，目前迫切需要经过验证的生物标志物。一项针对中国 CRC 患者队列的综合组学研究表明，基于原发性肿瘤的磷酸化蛋白质组数据可以区分转移性和非转移性 CRC。转移性 CRC 的磷酸化蛋白质组数据的显著特征是 MHC1 中磷酸化位点的下调以及 mTOR 信号通路和糖酵解途径中磷酸化位点的上调，这些可能是转移性 CRC 的潜在诊断生物标志物和潜在治疗靶点。参与抗原加工和呈递途径的 MHC1 的磷酸化有可能成为抗肿瘤免疫治疗的生物标志物和靶点。

KRAS 突变是预后不良和对抗 EGFR 治疗耐药的重要预测生物标志物，常见于 KRAS 基因外显子 2 的密码子 12（G12D）和 13（G13D）。然而，不同的 KRAS 突变似乎与不同的临床病理特征和对抗 EGFR 治疗的不同药物敏感性相关，这表明不同的 KRAS 突变会导致不同信号通路的激活。Raish 等人利用基于免疫亲和富集的磷酸化蛋白质组学揭示了 KRAS G12D 和 G13D 等位基因的磷酸酪氨酸特征。结果表明，两种 KRAS 突变存在不同的信号通路和代谢重编程模式。髓鞘蛋白零样 1（MPZL1）蛋白在 Tyr263 位点的过度磷酸化是 G12D 突变下游的一个新分子，敲低 MPZL1 与对 EGFR 抑制的敏感性增加有关。因此，MPZL1 可能作为 KRAS G12D 的生物标志物和潜在治疗靶点。研究人员越来越多地利用磷酸化蛋白质组学探索新的生物标志物，为携带 KRAS 突变的 CRC 提供更个性化的治疗选择。

抗表皮生长因子受体（anti-EGFR）单克隆抗体，如西妥昔单抗和帕尼单抗，是治疗 KRAS 野生型转移性 CRC（mCRC）的基石。然而，50% 的 RAS 野生型 CRC 患者对西妥昔单抗耐药，且目前仍缺乏经过验证的西妥昔单抗耐药生物标志物。西妥昔单抗耐药细胞的磷酸化蛋白质组数据显示，SRC-PRKCD 途径显著激活，SRC 抑制剂可逆转西妥昔单抗耐药。在 SRC 过表达的结直肠癌细胞中，酪氨酸磷酸化网络显示 SRC 与其他酪氨酸激酶途径（如 MET、EphA2 和 SGK223）之间存在广泛的相互作用。基于 MS 的磷酸化蛋白质组学构建的 HGF-MET 信号网络表明，MET 和 SRC 信号之间存在许多连接节点。因此，EGFR 下游途径的激活可能被视为抗 EGFR 单克隆抗体耐药的关键生物标志物，也是逆转 CRC 中抗 EGFR 治疗耐药的有效治疗靶点。

总之，蛋白质磷酸化是 CRC 中用于术后复发风险分层和转移性 CRC 个体化治疗的重要生物标志物。然而，目前大多数关于磷酸化蛋白质组学生物标志物的研究受样本量小的限制，仍处于临床前阶段。目前基于 MS 的 CRC 磷酸化蛋白质组学研究已整理在表 1 中。显然，迫切需要对磷酸化蛋白质组学进行更大规模的前瞻性队列研究，以及方法学优化和成本降低，以促进其在临床实践中的应用。

乙酰化

赖氨酸乙酰化和去乙酰化是动态且可逆的 PTM，其中乙酰基转移到赖氨酸残基的 ε- 氨基上。乙酰化的动态平衡由赖氨酸乙酰转移酶（KATs，也称为组蛋白乙酰转移酶）和赖氨酸去乙酰化酶（KDACs，也称为组蛋白去乙酰化酶）调节。50 多年前首次在组蛋白中描述的赖氨酸残基乙酰化，会导致赖氨酸残基的正电荷中和，诱导染色质结构松散和转录激活。除组蛋白外，乙酰化修饰也存在于非组蛋白蛋白质中，并广泛参与信号转导、细胞周期、染色质重塑、DNA 修复和复制、RNA 剪接、蛋白质稳定性和运输以及转录调控。越来越多的数据表明，乙酰化与肿瘤发生和癌症进展密切相关。组蛋白乙酰化导致癌基因和抑癌基因的转录活性异常，而非组蛋白乙酰化导致促癌因子和抑癌因子的稳定性和活性改变。因此，组蛋白和非组蛋白蛋白质的乙酰化是肿瘤发生和进展的关键生物标志物，也是治疗干预的潜在靶点。高分辨率质谱结合液相色谱以扩大乙酰化的检测范围，将加深我们对乙酰化在癌症中作用的理解，并促进乙酰化新生物标志物的发现。

基于 MS 的自下而上蛋白质组学已成为蛋白质乙酰化和位点鉴定的主要方法。蛋白质乙酰化分析的主要挑战是乙酰化蛋白质的化学计量比和丰度较低。因此，乙酰化肽的富集和分离是蛋白质乙酰化鉴定和定量的关键步骤。使用抗乙酰化赖氨酸抗体进行免疫亲和纯化富集可提高乙酰化 MS 分析的深度。SCX 是最常用的分离策略，通常与免疫亲和纯化富集相结合。

越来越多的证据表明，组蛋白乙酰化的失调与结直肠癌的发生和预后密切相关，涉及多种失调的酶，包括 KATs 和 KDACs。对结直肠癌样本和配对正常黏膜样本中组蛋白 PTM 的基于 MS 的分析表明，CRC 中组蛋白 H3 赖氨酸 27（H3K27ac）的乙酰化显著增加。一些报告表明，全局组蛋白乙酰化是结直肠癌晚期、淋巴结转移、预后不良和高复发风险的生物标志物。原发性结直肠癌组织和肝转移组织中乙酰化组蛋白的蛋白质组学研究，描述了原发性肿瘤和转移组织中乙酰化组蛋白的不同表达，结果显示肝转移中乙酰化组蛋白 H3/H2 在 Lys 19 和 H2B 在 Lys 121 处的变化最大。然而，一些特定乙酰化组蛋白的表达增加与良好的预后相关，例如，H3K12ac 和 H3K18ac 是组织学亚型分化较好的生物标志物，H3K56ac 和 H4K16ac 是复发风险较低和生存期较长的生物标志物。进一步明确组蛋白乙酰化及其下游靶基因在 CRC 肿瘤发生和转移中的作用，将有助于深入理解组蛋白乙酰化在癌症生物学中的意义。

非组蛋白乙酰化在 CRC 中也起着至关重要的作用，例如在 p53 中。基于 MS 的非组蛋白蛋白质乙酰化蛋白质组学表明，IDH1 K224 在转移部位的乙酰化水平显著增加，高水平的乙酰化 IDH1 与 CRC 中的晚期肿瘤、肝转移和生存率降低显著相关。因此，IDH1 乙酰化是 CRC 有前景的生物标志物和未来的治疗靶点。基于 MS 的 EGFR 的 PTM 鉴定出人类 CRC 细胞中 EGFR 的一种新修饰，K1037 乙酰化，由上游抗氧化多功能酶硫氧还蛋白（SRX）调节，它抑制 EGFR 磷酸化和激活。EGFR 的 PTM 与 EGFR 途径的激活和抗 EGFR 治疗的疗效密切相关，这是逆转西妥昔单抗耐药的一个有前景的方向。

组蛋白和非组蛋白蛋白质的乙酰化是 CRC 的重要生物标志物，靶向乙酰化的疗法，如组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACis），在临床前研究中已显示出在结直肠癌治疗中的良好应用潜力。然而，关于基于 MS 的结直肠癌全局乙酰化分析的文献仍然稀少，迫切需要在结直肠癌的分子生物学研究中更广泛地应用最先进的特定蛋白质组学方法来研究乙酰化。

糖基化

糖基化是最常见的翻译后修饰之一，包括两种主要类型的糖基化：发生在天冬酰胺残基上的 N - 糖基化和发生在丝氨酸或苏氨酸氨基酸残基上的 O - 糖基化。这是一个在内质网腔和高尔基体中进行的多步酶促过程，参与信号转导、免疫反应和癌症相关生物学等多个生物学过程。糖基化事件以及糖基化相关酶系统的失衡与多种病理状况（如癌症甚至 COVID-19）相关，在诊断和治疗的生物标志物中起着至关重要的作用。在结直肠癌中，生长因子受体（如 EGFR）的糖基化会改变药物 - 受体相互作用，可能是抗 EGFR 治疗耐药的潜在生物标志物，而参与糖基化的 N - 乙酰葡糖胺转移酶 V 与肿瘤发生和转移相关，可能是诊断和预后的潜在生物标志物。基于质谱的糖蛋白质组学系统地表征糖蛋白的糖基化位点和聚糖结构，有助于我们理解糖基化在结直肠癌肿瘤发生和进展中的生物学作用，并发现用于诊断和治疗的生物标志物。

糖基化肽的富集是蛋白质糖基化全局分析的关键步骤。传统的富集策略包括凝集素亲和色谱和酰化化学富集，这些方法通过去除糖链结构进行简化，也称为去糖蛋白质组学，但缺乏关于聚糖的重要信息。随着基于 MS 的糖蛋白质组学富集策略和技术的进步，糖型和糖基化位点正成为糖基化鉴定的主要目标。新的策略包括同位素靶向糖蛋白质组学（IsoTaG）、N - 连接聚糖和含糖基化位点肽的固相萃取（NGAG）以及基于硼酸的化学富集。IsoTaG 能够在全蛋白质组水平表征完整的、代谢标记的糖肽，但仅限于培养细胞样本。NGAG 能够表征单个糖基化位点的聚糖异质性，用于系统地表征 N - 糖蛋白质组。Yang 及其同事开发了一种基于硼酸修饰的介孔磁性颗粒的多模态材料，在富集微量样本中的糖肽方面非常有效。基于 MS 的蛋白质糖基化测定的另一个技术问题是糖基化后没有恒定的质量位移。因此，需要建立糖基化的质量标签，以便使用 MS 识别糖基化位点。N - 糖基化的质量标签通常由 PNGase F 水解或化学去糖基化产生，而 O - 糖基化的质量标签由 β-elimination产生。

Enrichment strategies and mass tags for glycoproteomics.

癌细胞分泌的糖蛋白和位于细胞膜表面的糖蛋白是结直肠癌早期诊断的关键线索。糖蛋白质组学鉴定了结直肠癌中糖蛋白的差异表达，发现如ICAM1、APMAP、Annexin 4、Annexin 5、Annexin A1和CLCA1等膜结合糖蛋白是结直肠癌诊断的敏感且特异的生物标志物，这些标志物需要在血浆[86–89]中验证。来自血浆中与癌症相关的外显子的FGB）和β2-GP1在结直肠癌的诊断中比CA199具有更高的灵敏度和特异性。结直肠癌细胞的外囊泡糖蛋白质组学显示，转移细胞中的O-GlcN 蛋白水平高于非转移细胞。O-GlcN 的胞外囊泡蛋白可能在肿瘤细胞中传递距离信息的功能，并可成为结直肠癌转移的潜在生物标志物。综上，糖基化蛋白是结直肠癌的重要生物标志物，而糖基化免疫球蛋白可能是结直肠癌免疫治疗的潜在生物标志物和潜在靶点。

总结

基于质谱的蛋白质组学发现大量具有 CRC 诊断或治疗潜力的蛋白质靶点，多种蛋白质翻译后修饰（PTM）及修饰位点被发现与 CRC 发生、发展和干预的分子机制密切相关。

• PTM 研究范围与方法：目前关于 CRC 中 PTM 的研究多集中在磷酸化、乙酰化和糖基化等少数几种，而其他 PTM（如甲基化、泛素化、瓜氨酸化）作用渐显，需系统探索更多 PTM 的功能机制，且当前富集策略和质谱方法有待改进以全面分析每种 PTM。
• PTM 间的相互作用：尽管对多种 PTM 在生物过程中的研究增多，但 PTM 间的串扰（多种 PTM 的协调）未得到充分关注，虽已发现一些 CRC 中 PTM 串扰的证据（如 PRMTs 和 EGFR 相关的 PTM 串扰），但还需进一步功能测定来研究其相互作用。
• 临床转化：大量临床研究已鉴定出数千种与疾病相关的 PTM，但其临床转化不成熟，作为生物标志物的重要性缺乏大规模临床试验验证，检测和富集这些 PTM 的抗体匮乏阻碍了常规临床技术应用，研究人员尝试探索质谱（MS）在临床的应用，虽 MS 尚未成为临床诊断常规工具，但有望成为测量具有临床潜力的翻译后修饰肽和蛋白质的有力手段 。

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货号	产品名称	反应种属	修饰
S0F0006	Anti-2-hydroxyisobutyryllysine agarose Beads	Species Independent	Khib（赖氨酸2羟基异丁酰化）
S0F0005	Anti-K-ε-GG agarose Beads	Species Independent	泛素化
S0F0010	Anti-Succinyllysine agarose Beads	Species Independent	琥珀酰化
S0F0007	Anti-Phosphotyrosine agarose Beads	Species Independent	酪氨酸磷酸化
S0F0003	Anti-L-lactyllysine agarose Beads	Species Independent	乳酸化
S0F0009	Anti-O-GlcNAc agarose Beads	Species Independent	糖基化
S0F0004	Anti-acetyllysine agarose Beads	Species Independent	赖氨酸乙酰化
S0F0013	Anti-K-ε-GV Agarose Beads	Species Independent	犹素化

Reference
https://doi.org/10.1016/j.bbcan.2022.188735

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