摘要

胆汁是肝脏分泌的一种重要物质，它有助于在肠道中消化食物中的脂肪。胆汁酸（BAs）是胆汁的主要有机溶质成分。这些胆汁酸由肝脏中的胆固醇合成，并储存在胆囊中。当胆汁酸分泌到十二指肠区域后，在远端小肠（回肠）中被重新吸收，并通过门静脉循环返回肝脏。在肠道中，胆汁酸会被肠道细菌产生的胆盐水解酶去结合（即去除甘氨酸或牛磺酸部分）。

胆汁酸被分为两大类：主要胆汁酸（如胆酸-CA、熊去氧胆酸-CDCA）和次要胆汁酸（如脱氧胆酸-DCA、石胆酸-LCA）。1主要胆汁酸由肝细胞合成，而次要胆汁酸则是通过肠道细菌对主要胆汁酸的代谢作用生成。人肝脏主要合成初级胆汁酸CA和CDCA，小鼠主要从CDCA合成CA和6-羟基化鼠胆酸（MCA）。3种胆汁酸可进一步分为非结合型和结合型（如甘氨胆酸-GCA、牛磺胆酸-TLCA）组（结构总结见图1）

胆汁酸（BAs）调控多种重要的生物功能，包括脂质和葡萄糖代谢、营养物质的消化与吸收、体温调节、能量平衡、胆汁酸合成及胆固醇平衡。许多疾病源于胆汁酸失衡，如胆汁酸腹泻（或吸收不良）、胆汁酸合成障碍以及多种肝内胆汁淤积症。幸运的是，胆汁酸疗法正逐渐成为治疗非酒精性脂肪肝、原发性胆汁性胆管炎和代谢综合征（包括高血糖、高甘油三酯血症、胰岛素抵抗和肥胖）的治疗选择。

鉴于胆酸（BAs）在生物和功能上的重要性，其在组织（如肝脏、肠道、粪便）和生物流体（如尿液、血液）中的水平正逐渐被研究作为肝功能、损伤和疾病的潜在生物标志物。在这些研究中，通常使用质谱（MS）方法结合相应的稳定同位素标记标准品来量化游离和结合的胆酸。一种常用的方法是将反相液相色谱（RPLC）与质谱仪联用，采用负离子模式下的多反应监测（MRM）或选择反应监测（SRM）进行数据采集。然而，分析技术的发展受到了胆酸化学相似性（异构体和等重异构体）及其在生物基质中浓度范围广泛（从纳摩尔到毫摩尔）等多方面因素的挑战。

本文介绍了新开发的使用CIL胆酸标准混合物的方法，并讨论了该方法在肝病研究中的应用结果。该方法解决了先前分析中遇到的一些难题，成功实现了对所有16种胆酸目标的基线分离。在研究应用中，通过使用肌球蛋白Vb（myoVb；基因MYO5B）缺失的动物模型，研究了远端回肠和肝脏中胆汁酸组成的改变（见图2）。

MyoVb是一种分子马达，负责将关键物质运输到上皮细胞的顶端膜。10个影响MyoVb功能的突变会导致人类出现微绒毛包含病（MVID），这种疾病会引起危及生命的腹泻。11,12 MVID患者常伴有肝胆汁淤积症，这是一种由于胆汁流动减少或受阻引起的疾病。13,14目前尚不清楚肝胆汁淤积症和功能性MyoVb缺失时胆汁酸组成变化的原因，因此本研究旨在通过调查这些因素来增进对这一机制的理解。

材料与方法

化学品与试剂

所有试剂均为最高可用等级，溶剂为LC-MS级。在储存这些化学品和试剂时，遵循制造商的建议。CIL的稳定同位素标记胆酸混合物（未结合型，货号MSK-BA1；结合型，货号MSK-BA2)用作内标（IS）。CIL的未标记胆酸混合物（未结合型，货号MSK-BA1-US；结合型，货号MSK-BA2-US)用作真实参考材料。这些混合物用于特定化合物的质谱仪优化及校准标准品的制备。所有混合物均在-80°C（避光）下以纯品和溶液形式储存，直至使用。

溶液制备：将干燥的D-标记BA IS混合物分别溶解于1毫升甲醇与水(1：1，体积比）中，随后进行几分钟的涡旋混合。这样可以得到浓度~100微摩尔的IS储备液。接着，将每份IS储备液的等分试样稀释至250纳摩尔，置于含有50毫升甲醇与水(1：1，体积比）的单个玻璃瓶中。这种IS工作溶液被标记为溶液A，并用于生物样品提取物的制备。另一种IS工作溶液，称为溶液B（用于中间和校准标准品的制备），通过将9毫升溶液A与1毫升甲醇与水(1：1，体积比）在玻璃瓶中稀释制备，其浓度为225纳摩尔。
类似于D标记的BA IS溶液制备方法，每个未标记的BA混合物分别溶解在1毫升甲醇与水(1：1，体积比）的混合液中，随后进行几分钟的涡旋混合。这样可以得到浓度~100微摩尔的清晰分析物储备溶液。通过将每种未标记分析物储备溶液的0.1毫升稀释到含有0.8毫升溶液B的玻璃瓶中，并进行短暂的涡旋混合，制备了浓度为10微摩尔的中间溶液。溶液B作为制备校准标准品的稀释剂（见表1）。

小鼠MVID模型用于研究肝胆汁淤积。最近，研究人员开发并研究了缺乏myoVb的生殖系小鼠（KO小鼠），以了解myoVb缺失对肠上皮的影响。新生的生殖系myoVb KO小鼠表现出多种肠道异常，包括细胞内微绒毛内含物、绒毛融合、过度增殖、极性蛋白变化和顶端转运蛋白缺陷。此外，这些小鼠的生长速度比同窝对照小鼠慢，并且大约在出生后3-7天因脱水而死亡。尽管肠道在myoVb KO小鼠中已得到充分研究，但肝脏生理变化尚未被记录，尽管新的研究表明myoVb突变与肝胆汁淤积有关。我们使用之前描述的myoVb KO小鼠来研究myoVb缺失对肝脏和肠道胆汁酸调节的影响。我们的数据表明，生殖系myoVb KO小鼠不仅可能作为人类疾病肠道模型，也可能作为肝胆汁淤积的肝脏模型。
组织收集与均质化
新生小鼠（每组3只，包括敲除组和对照组）在年龄较小的情况下，通过二氧化碳安乐死并随后断头。此程序遵循了MUSC批准的IACUC协议（编号#2021-01252）。在小鼠腹部切开后，取出肝脏和回肠。每个组织样本的质量被称重，并放入含有0.1克1.4毫米陶瓷珠（MP Biomedical产品编号116540434）的组织均质化管中。向每个含有组织样本的试管中加入等同于200 mg/mL组织密度的冰冻甲醇。使用BeadBug组织均质器（或类似设备）在4 m/s下进行两次均质化处理，每次20秒。均质后的组织碎片通过在室温下以16,000×g离心5分钟来沉淀，然后将上清液转移至新的2.0 mL冷冻管中。这些样本在-80°C下保存，直至进行LC-MS/MS分析。
LC-MS/MS样品制备
在分析时，将组织样本从-80°C的冷冻环境中取出，并在实验室台面上逐渐升温至室温。使用300微升的玻璃自动进样器HPLC容器(13毫米内径，带微插件；赛默飞世尔科技），将每份甲醇化、均质化的组织样本10微升的体积稀释在90微升的溶液A（即标记的内标物）中。随后，盖上自动进样器瓶盖，并进行短暂的涡旋混合。此外，还放置了条件标准品(Cond Cal A，所有BAs的浓度为2.44纳摩尔）、试剂空白（RBlk）样品（即溶剂）、空白内标物样品(Blk-IS，浓度为0纳摩尔校准物）、校准物（每个A至F水平n=3次注射，例如Cal A），以及混合质量控制（QC）标准品（例如，用于混合回肠QC的pooled IlQC）。Shimadzu Nexera SIL-30ACMP自动进样器配备了1.5毫升聚丙烯瓶架（每个瓶架有54个瓶位），以容纳上述指定的玻璃自动进样器容器。所有样品均在柱上注入15微升，进行LC-MS/MS分析。
RPLC系统条件和梯度程序
BAs的LC分离在Raptor C18柱（100×2.1 mm内径，2.7μm；Restek）和Ultra C18保护柱（10 x 2.1 mm内径，5μm；Restek）上进行。在整个运行过程中，柱和样品盘分别保持在50°C和4°C。在15微升的柱上注射后，分析物在17分钟的梯度（见表2）中以0.3毫升/分钟的流速分离。流动相的组成如下：
洗脱液A：10 mM甲酸铵水溶液；洗脱液B：乙腈

MS/MS描述及采集方法参数​
LC-MS/MS平台由一台Shimadzu（日本京都）的Nexera-XR MP UHPLC系统和一台SCIEX（美国马萨诸塞州弗雷明汉）的QTRAP®6500质谱仪组成，使用上述描述的保护柱和分析柱。TurboIonSpray®（电喷雾电离源）探针安装在IonDrive™Turbo V离子源中，该离子源以负离子模式运行。表3列出了本方法中使用的全局MS仪器参数，而表4则列出了稳定同位素标记标准品的预定MRM（单分子多反应监测）采集的分子特异性参数。除非另有说明，分子特异性参数是通过注入纯BA溶液（浓度为1微克/毫升，甲醇：水1：1，体积比）来经验性调整的。对于标记和未标记的标准品，每个BA监测两个跃迁，总计64个MRM跃迁。由于实施了sMRM扫描，每个MRM跃迁的占空比和驻留时间是动态的，并由采集软件（Analyst®，版本1.6.2；SCIEX)控制。
分析数据
LC-MS/MS系统的操作控制使用了Analyst®（版本1.6.2)，数据分析则在MultiQuant™（版本3.0.1；SCIEX)和Microsoft Excel中完成。在结果解释前，通过手动检查目标BAs的峰选择和积分来验证。对于所有16种BAs，构建了无基质的校准曲线（从A点2.44 nM到F点2.5µM，每个点有3次注射），校准曲线采用1/x加权因子，通过绘制每个校准物的测量响应比（未标记/标记）与制备浓度的关系图来构建。BA内标用于标准化内源性BA化合物，样品提取物中均质组织的质量被纳入浓度测定计算中。BA的浓度以每克匀浆组织中的纳米摩尔数表示。在生成热图之前，每个BA的标准化组织浓度在所有样本中进行了十分位数缩放。具体来说，最低和最高的浓度值分别被设定为0和1，而中间的每个值则根据这一标准进行缩放。热图是使用开源数据分析和可视化软件包Orange（版本3.29.1)生成的。
结果和讨论方法
开发和BA定量
针对16种目标BAs的sMRM跃迁，其分子特异性参数在QTRAP 6500上通过实验优化。对于非等重BAs（如CA、DCA、LCA、TCA、TLCA、GCA和GLCA)，通过将含有所有BAs的混合中间溶液以1µg/mL的浓度注入甲醇-水（1：1，v/v）中进行10倍稀释来实现优化。对于具有共同前体和/或产物离子的等重BAs，使用单独调谐溶液进行优化，这些溶液以1µg/mL的浓度制备，溶剂为1：1的甲醇-水（分别对应β-MCA、CIL产品编号DLM-10626；CDCA、CIL产品编号DLM-6780；UDCA、CIL产品编号DLM-9574；TCDCA、CIL产品编号DLM-9562；TUDCA、CIL产品编号DLM-9882；TDCA、CIL产品编号DLM-9568；GCDCA、CIL产品编号DLM-7804；GUDCA、CIL产品编号DLM-9558；GDCA、CIL产品编号DLM-9554)。通过轻微调整先前优化的梯度程序，我们的最终方法能够提供所有BAs的基线分辨率。例如，可以观察到等重TUDCA、TCDCA和TDCA BAs（见图4）以及GUDCA、GCDCA和GDCA（见图5）的基线分离。

这些批次中包含了系统适用性、残留量和合并的质控测量（质控数据未显示）。这些措施旨在评估方法性能。系统适用性测试通过三次注射最低校准标准品（Cal A；2.44 nM，用于BAs）进行。随后，对三次Cal A注射中测量到的每个BAs峰进行了积分，并计算了精度（%CV）。表5展示了我们典型的系统适用性精度结果。

系统适用性试验中发现的高精密度为分析系统适用于实验样品分析提供了信心。
在残留评估中，计算了序列批次中未标记和D-标记BA响应（峰面积）的比例，这些响应是在第三次Cal H（所有BAs均为2,500 nM）后注入的空白样品中测得的，与三次Cal A注射中的平均未标记和D-标记BA响应相比。残留以百分比形式表示，未标记BAs的典型残留结果见表6，D-标记BA IS化合物的残留结果见表7。
研究结果
显示，未标记的BA分析物和D-标记的IS化合物的残留量几乎可以忽略不计，其精度甚至达到了FDA-GLP的要求（即，未标记分析物的残留量低于20%，IS化合物的残留量低于5%）。这进一步证明了所开发方法的有效性和分析平台的可靠性。
研究结果表明，体内肌动蛋白Vβ（myoVb）的缺失会导致多种肠道功能障碍。然而，肌动蛋白Vβ在其他器官系统中的作用及其对胆汁酸（BAs）调节的影响尚不明确。我们测量了同窝对照组和肌动蛋白Vβ基因敲除小鼠的胆汁酸组成，以确定这些变化是否由远端肠道和肝脏中肌动蛋白Vβ功能丧失引起。
种系myoVb KO小鼠的肝脏中CA、DCA、β-MCA、GCA、TUDCA、TCDCA和TCA水平显著降低（见图8）
这些数据表明，myoVb的缺失可能影响BA信号传导或BA的组装。在回肠中测量BA时发现，与同窝对照组相比，myoVb基因敲除小鼠的CA和β-MCA水平显著升高（见图9）。

这表明，myoVb的缺失可能会阻止BAs从肠细胞正确运输到肝循环，从而将BAs送回肝脏进行循环。
总体而言，同窝对照组与myoVb基因敲除小鼠之间胆汁酸（BAs）组成的差异表明，myoVb的缺失影响了肝脏和肠道中胆汁酸的正常生成和循环。此外，这也提示myoVb可能在肝脏和肠道中调节胆汁酸信号通路（即FXR途径）。
结论和展望
开发的LC-MRM/MS方法提供了一种新的手段，能够以高通量的方式基线分离多种胆汁酸（BAs），其中一些胆汁酸具有同量异位物。在实际应用中，该方法揭示了关于体内肌球蛋白Vb丢失的几个有趣发现。结果显示，肝脏中的CA、DCA、β-MCA、GCA、TUDCA、TCDCA和TCA显著减少。值得注意的是，在肌球蛋白Vb敲除的小鼠中，回肠组织中的CA和β-MCA含量高于同窝对照组。这些数据表明，小鼠肝脏和胃肠道组织样本中胆汁酸的测量结果，提示功能性肌球蛋白Vb的缺失可能影响了肝脏胆汁酸的产生或分泌。下一步，我们将分析缺乏肝细胞肌球蛋白Vb的成年小鼠体内产生的胆汁酸组合。我们还计划将此方法扩展到新生儿和成年小鼠的胆汁淤积性肝病模型中，以测量循环胆汁酸的水平。总的来说，能够准确测量实验模型中个别胆汁酸的方法，如本研究所开发的方法，是深入了解复杂胆汁酸作用机制的关键工具。