图1. NGN2-iN神经元亚型组合模式化筛选

(A) NGN2-iN组合模式化筛选实验设计与时间线，采用单细胞转录组测序(snRNA-seq)结合分池组合条形码技术(Parse Biosciences)分析192种形态发生素组合。(B) 184,431个细胞的UMAP降维图，按细胞簇(左)和AP/DV形态发生素来源(右)着色。(C) 代表性标志基因表达特征图。(D) 模式化NGN2-iN细胞簇的标记基因、转录因子和离子通道表达热图。(E) 基于原代神经元参考图谱注释的UMAP图，显示神经系统分区(左上)、区域(右上)、神经元类型(左下)和匹配评分(右下)。缩写：CNS中枢神经系统；PNS外周神经系统；SYM交感神经系统；ENS肠神经系统；TG三叉神经节；DRG背根神经节；GLUT谷氨酸能神经元；CHO胆碱能神经元；NOR去甲肾上腺素能神经元；NBL神经母样细胞。(F) 模式化NGN2-iN各细胞簇的代表性标志基因热图，侧边栏显示转移注释。(G) 第6周模式化NGN2-iN与星形胶质细胞共培养的免疫荧光染色，MAP2(上排)和SLC17A6(下排)呈黄色，DAPI呈青色。比例尺：20μm。(H-I) 第10天模式化NGN2-iN的亚型特异性标志物特征图(H)和免疫荧光染色(I)，包括SLC5A7、SLC6A2、NTRK1和TRPM8。比例尺：20μm。

HD-MEA揭示NGN2-iN的功能与形态多样性
研究通过高密度微电极阵列（HD-MEA）技术系统分析了模式化 NGN2-iN 的电生理和形态学特征。

选取6种典型条件进行多尺度检测，发现不同处理组神经元呈现独特的动作电位模式和放电特性，聚类分析鉴定出11种功能表型。网络水平分析显示形态发生素特异性调控神经环路特性，如CHIR处理组具有可重复的电生理特征。药理学实验证实AMPA受体拮抗剂可普遍抑制神经活动。轴突重建与Sholl分析揭示不同条件诱导的形态多样性，且轴突复杂度与转录组成熟度高度相关。这些发现证明组合模式化不仅能产生功能成熟的神经元，还可通过精确调控获得特定电生理和形态特征，为神经回路构建和疾病模型研究提供了重要工具。
 

图2. 模式化NGN2-iN的电生理表征

(A) 星形胶质细胞-NGN2-iN在高密度微电极阵列(HD-MEA)共培养示意图。HD-MEA可高时空分辨率表征神经网络活动与轴突形态。电生理记录于接种后第14天进行(n=66个培养体系)。(B) 六种模式化条件下单个神经元的动作电位序列示例，每条线代表一个锋电位。(C) 所有推断的单细胞特征UMAP图(n=14,997个神经元)，按Louvain聚类结果着色。(D) 各培养体系单细胞簇组成相似性热图，基于(C)中簇身份计算。(E) 所有单细胞和网络特征的UMAP图(n=66个培养体系)，按模式化条件着色。(F) 雷达图显示五个最重要电生理特征，以对照组为基准归一化。(G) AMPA/红藻氨酸受体拮抗剂CNQX处理前后单神经元放电频率箱线图(n=43个培养体系)。箱体表示中位数和四分位距，散点为各培养体系平均放电频率。(H) 基于HD-MEA电信号重建的98个神经元轴突形态，展示每组6个示例。小圆圈示假定胞体/轴突起始段，颜色梯度示动作电位传导方向。(I) Sholl分析两个代表性参数的箱线图(数值经Z标准化)，散点代表单个轴突重建结果。(J) 所有Sholl特征的UMAP图，着色同(I)。(K) 组合筛选scRNA-seq数据中7303个神经元的转录组成熟度评分箱线图。(L) 转录组成熟度评分与Sholl特征的散点图，标记点为各条件均值。

形态发生素组合激活特异性基因调控网络塑造NGN2-iN神经元多样性
研究系统解析了形态发生素组合调控NGN2-iN多样性的分子机制。
通过分析192种处理条件的单细胞数据，发现不同形态发生素具有独特的调控特性：RA呈现强剂量依赖性，促进后脑胆碱能神经元；BMP4主导外周神经系统特化；而RA+BMP4等组合表现出协同效应。机器学习模型揭示RA和CHIR能引发梯度转录响应，而SHH/FGF8的作用较早饱和。
基因调控网络分析鉴定出形态发生素特异的调控子（regulon）：RA激活HOXB4/RARB等后脑决定因子，BMP4通过PHOX2B/MSX1驱动外周神经特征，FGF8相关调控子偏好中脑命运。这些调控子活性与浓度正相关，且在不同细胞系间稳定存在。研究首次在单细胞层面建立了"形态发生素组合-调控网络激活-神经元命运决定"的完整因果关系，证明组合信号通过协同激活特定转录因子网络实现神经亚型精准调控。
 

图3. 组合形态发生素诱导神经元多样性的调控机制解析

(A) 各组合条件对NGN2-iN细胞簇贡献的热图，细胞数经标准化。(B) 点图显示形态发生素组合引起的细胞组成与身份变化，点大小表示簇比例，连线示簇连续性。(C) 各条件生成的细胞簇数量。(D) 随机森林模型预测的形态发生素浓度与实际浓度对比。(E) 以形态发生素信号调节剂为中心的基因调控网络(GRN)，椭圆节点为形态发生素，圆形节点为调控子(转录因子及其靶基因)，边色示关联强度，节点大小示靶基因数量。(F) 单细胞TF敲除(KO)实验设计。(G) 基于组合筛选参考注释的KO细胞UMAP图。(H) 调控子活性(上)与KO细胞存在度(下)特征图，蓝色示KO后减少。(I) 单细胞TF过表达(OE)实验设计。(J) TF-OE数据UMAP(上)及其与组合筛选的映射(下)，均按外源TF着色。(K-L) TF-OE细胞密度(K)与对应调控子活性(L)特征图。

模式化NGN2-iN命运决定的形态发生素-GRN调控机制
通过单细胞水平的基因编辑和过表达实验，验证了形态发生素通过特定转录因子调控网络（GRNs）决定神经元亚型的机制。

敲除实验显示，LHX9、MSX1等关键转录因子的缺失会特异性消除对应调控子活跃的神经元亚群，如MSX1敲除减少外周神经细胞，HOXB3敲除抑制后脑神经元生成。过表达实验则证明，NGN2与亚型特异性TF（如PHOX2B等）的组合表达，无需外源形态发生素即可诱导目标神经元亚型，且纯度更高。特别发现某些TF（如MSX1）的过表达效果受时序调控影响。这些结果不仅证实了形态发生素-GRN推断模型的准确性，更建立了"核心TF组合决定神经元命运"的普适性规律，为神经再生医学提供了精准操控细胞命运的新范式。

预模式化神经祖细胞状态决定NGN2诱导神经元的独特身份特征
预模式化指的是在诱导神经分化（如表达NGN2/ASCL1等先驱转录因子）之前，先通过形态发生素处理多能干细胞，使其先分化为具有特定区域身份的神经祖细胞（NPCs），再进行神经元诱导。后模式化指的是诱导多能干细胞直接分化为神经元（如通过NGN2过表达），之后再施加形态发生素进行区域特化。

研究通过对比预模式化与后模式化策略，揭示了神经祖细胞初始状态对终末神经元身份的决定性作用。设计96种预模式化条件结合单细胞多组学分析，发现不同处理会塑造神经祖细胞特异的表观遗传：前脑祖细胞富集OTX2结合位点，后脑祖细胞则呈现CDX4调控特征。NGN2作为先锋因子，通过开启与神经成熟相关的染色质封闭区域启动分化。关键发现包括：（1）预模式化神经元保留祖细胞的区域身份，证明NGN2主要执行分化而非区域化功能；（2）RA天然诱导后脑祖细胞表达NGN2，揭示内源调控机制；（3）预模式化产生更接近体内发育的神经元亚型，且异质性更低。
 

图4. 多样化预模式化输入状态下的NGN2诱导扩展神经元多样性

(A) 预模式化筛选与NGN2诱导实验设计。(B) 预模式化神经干/祖细胞UMAP图，按注释着色。(C) 按可及区域基序富集[NES]着色的UMAP图。(D) 基序富集与TF表达相关性散点图。(E) NGN2基序可及性差异的ATAC峰示例。(F) NGN2基序可及/不可及关联基因的GO分析。(G-H) 304,912个预模式化NGN2-iN细胞的UMAP图，按簇身份/形态发生素来源(G)或原代注释/基础培养基(H)着色。(I) 预模式化神经干/祖细胞与NGN2-iN的神经身份组成相关性，每点代表一个形态发生素组合。

预模式化与后模式化NGN2-iN在细胞组成、成熟度及调控子活性上的比较
研究系统比较了预模式化与后模式化NGN2神经元的特征差异。
预模式化产生更接近体内神经元的均质群体，但成熟较慢且含更多未成熟胶质细胞；后模式化神经元成熟更快但异质性更高。关键发现包括：（1）预模式化能获得视网膜前体等特殊亚型；（2）祖细胞的表观遗传记忆延缓但优化了分化进程；（3）相同形态发生素在不同时序激活差异化的调控网络。例如RARB在两种模式下虽均调控后脑命运，但靶基因谱不同。这些发现不仅揭示了神经分化时序调控的重要性，更证明祖细胞初始状态如同"发育密码"，持续影响终末神经元的功能特性，为优化体外神经分化体系提供了重要指导。
 

图5. 预模式化与后模式化NGN2-iN的比较

(A) 整合数据集489,343个细胞的UMAP图。(B-C) 区域身份(B)和细胞类型(C)频率组成比较。(D) 基于神经递质分泌和突触组装相关基因的成熟度比较。(E-F) 异质性(E)和原代相似性(F)比较。(G) 预/后模式化调控子与RA/BMP4活性的相关性比较，点大小示调控子规模。

转录因子诱导结合组合模式化的普适性细胞编程策略
通过将组合模式化策略拓展至ASCL1-DLX2诱导的抑制性神经元，建立了普适性细胞编程体系。

关键发现包括：（1）不同先驱转录因子（NGN2/ASCL1-DLX2）结合相同形态发生素组合可产生截然不同的神经元亚型谱系，证明该策略具有广泛适用性；（2）预模式化虽提高细胞纯度但伴随更多脱靶细胞，揭示DLX2等多效性因子的谱系限制作用；（3）构建的整合神经元图谱包含185个分子特征明确的亚群，最高纯度达84%，为神经科学研究提供丰富资源；（4）发现形态发生素浓度与神经肽表达的定量关系（如CHIR-NPY、BMP4-生长抑素），为疾病模型构建提供调控靶点；（5）系统比较显示模式化iNs能准确模拟原代神经元的转录因子网络和电生理特征，但在能量代谢方面存在显著差异，提示体外体系仍需优化。这些发现不仅证实了"转录因子+形态发生素"组合策略在神经分化中的普适性，更通过建立表型-条件-调控网络的定量关系，为再生医学和疾病建模提供了标准化细胞编程框架。特别值得注意的是，研究揭示了体外培养环境对细胞代谢的重编程效应，这为改进神经元成熟度提供了重要方向。
 

图6. 组合模式化产生多样化GABA能ASCL1/DLX2-iN

(A) ASCL1/DLX2诱导的预/后模式化筛选设计。(B) ASCL1/DLX2-iN的UMAP图。(C) 430,936个神经细胞的整合图谱UMAP。(D) 形态发生素浓度与转录差异的散点图。(E) 基于转录组距离的聚类树状图，热图示各簇最佳条件的浓度，条形图示簇纯度。(F) NGN2与ASCL1/DLX2-iN调控子与BMP4/RA相关性比较。(G) 形态发生素对神经递质/神经肽基因表达的随机森林预测重要性热图。(H) 神经递质/神经肽表达与形态发生素浓度的箱线图。

研究总结
这篇研究通过系统筛选480种形态发生素组合，结合单细胞测序、高密度微电极阵列（HD-MEA）等技术，在人类干细胞中建立了定向诱导多样化神经元亚型的普适性策略。
研究发现预模式化（先区域化后分化）能产生更接近体内神经元的亚型，而后模式化（先分化后区域化）则更快速高效。通过解析形态发生素-转录因子调控网络，研究不仅揭示了神经元命运决定的协同信号机制，还构建了包含400余种亚型的神经元图谱。该成果为神经系统疾病建模、药物筛选和细胞治疗提供了重要工具和理论框架，是干细胞神经定向分化领域的重大突破。

参考文献：
Lin HC, Janssens J, Eisinger B, et al. Human neuron subtype programming via single-cell transcriptome-coupled patterning screens. Science. 2025 Jul 10;389(6756):eadn6121. doi: 10.1126/science.adn6121. 

想要获取本篇文献的老师同学们，可以拉到文末扫码添加礼智小客服哦！