方案摘要：本方案登革病毒中和试验中应用了 Pipetty 电动移液器，以实现对血清中登革病毒中和抗体的精准检测。试验基于登革病毒与特异性中和抗体结合后会失去感染能力的原理，采用组织培养中和试验法。通过 Pipetty 电动移液器的混匀、连续分液等功能，完成病毒 TCID50 测定、血清系列稀释、抗体与病毒混合孵育、接种细胞培养等步骤，借助观察细胞病变效应（CPE），按 Reed-Muench 法判定中和抗体滴度，并通过对照验证确保试验有效性。该方案利用 Pipetty 电动移液器的精准操作，提高了试验的准确性与效率，为登革病毒感染的诊断及相关研究提供可靠支持。
 
方案详情：
一、实验原理
       当人体感染登革病毒后，血清中可产生保护性的中和抗体，登革病毒与这种特异性抗体作用后，能被特异性地“中和”，抑制登革病毒的复制与繁殖，使其失去感染能力。中和试验包括动物中和试验、组织培养中和试验和空斑减少中和试验三种，每种中和试验又分为固定病毒稀释血清法和固定血清稀释病毒法两种。动物中和试验由于需要特殊的感染动物房，一般的实验室很难做到，所以更多的实验室采用的是组织培养中和试验和空斑减少中和试验，其中空斑减少中和试验比组织培养中和试验更敏感、特异，但由于前者对操作技术的要求更高，而且病毒噬斑小，出斑时间长，对细胞覆盖培养基的要求也高，故一般实验室多用的是组织培养中和试验。
二、‌实验准备
1、设配和材料
① Pipetty电动移液器MSIC01-03-250、MSIC01-02-1000及配套吸头；
② 无菌细胞吹打管、吸管；
③ 无菌平底微量 96 孔组织培养板；
④ 无菌 1.5mL 塑料离心管；
⑤ 冰盒；
⑥ C0₂培养箱；
⑦ 生物安全柜；
⑧ 倒置显微镜。
 
2、试剂和材料
① 登革病毒 1~4型标准毒株、C6/36 细胞、阳性和阴性对照血清;
② Vero 细胞
③ 细胞培养液：如含 10% 胎牛血清的 DMEM 或 RPMI-1640；
④ 维持液：含 2% 胎牛血清的培养液；
⑤ 对照样本：阴性血清、阳性血清。
 
 
 
三、实验步骤
1、病毒 TCID₅₀测定（提前 1-2 天完成）
a) 使用Pipetty电动移液器的混匀模式，将标准病毒株用维持液做 10 倍系列稀释（10^-1 至 10^-8）；
 
b) 设置连续分液模式，在96孔板中每孔加入 100μL 稀释后的病毒液，每个稀释度设 4 复孔；
c) 加入预先铺好的 Vero 单层细胞（每孔约 1×10⁴个细胞），37℃、5% CO₂培养；
d) 每日观察 CPE（细胞变圆、脱落、聚集等），持续 5-7 天；
e) 按 Reed-Muench 法计算 TCID₅₀，确定 100 TCID₅₀对应的病毒稀释倍数。
2、用维持液对待检血清、阳性对照血清、阴性对照血清做 2 倍系列稀释（如 1:10、1:20、1:40…… 至 1:1280），每稀释度设 3-4 复孔。
3、使用Pipetty电动移液器，按1:1的方式，取适量血清和含 100 TCID₅₀的病毒液添加至离心管，充分混匀后，设置连续分液模式，在孔板中每孔加入 200μL 的混合液；
4、设置对照孔：
a）病毒对照：100μL 维持液 + 100μL 100 TCID₅₀病毒液；
b）细胞对照：100μL 维持液 + 100μL 维持液（无病毒和血清）；
c）37℃孵育 1 小时（让抗体与病毒充分结合）。
5、接种细胞并培养
a）弃去 96 孔板中预先铺好的 Vero 细胞的原有培养液；
b）设置连续分液模式，在孔板中每孔加入上述中和反应后的混合液 100μL，37℃、5% CO₂培养箱中培养；
 
c）培养 2-3 天后，若培养液变黄，可半量更换维持液（避免细胞营养不足）。
6、每日用倒置显微镜观察 CPE，记录各孔是否出现 CPE（以 “+” 表示有 CPE，“-” 表示无 CPE），观察至病毒对照孔出现 75% 以上 CPE（通常 5-7 天），且细胞对照孔无 CPE 时终止观察。
四、结果判定
1、中和抗体滴度定义：能抑制 50% 复孔出现 CPE 的血清最高稀释度的倒数。
2、计算方法：按 Reed-Muench 法，统计各稀释度血清中 “无 CPE 孔” 的比例，找到抑制 50% CPE 对应的稀释度。
3、对照验证：
a）病毒对照孔必须出现明显 CPE；
b）细胞对照孔必须无 CPE；
c）阳性对照血清滴度需在预期范围，阴性对照血清应无中和作用（即所有复孔均出现 CPE）。