方案摘要：繁殖与呼吸综合征（Porcine Reproductive and Respiratory syndrome，PRRS），是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory syndrome virus，PRRSV）感染猪引起的一种高度传染性疫病，临床表现为母猪繁殖系统障碍，断奶仔猪消瘦、生长迟缓以及死亡率增加。该病能引起猪只体温升高、呼吸困难，导致猪耳朵发绀，又称蓝耳病，本方案覆盖 PRRSV 病毒分离（含病料预处理、敏感细胞接种、无病变时盲传纯化）与后续鉴定环节：分离阶段，通过移液器精准移取病料上清、抑菌抗生素及细胞培养液，严格把控接种体积与盲传移液量；鉴定阶段，借助移液器定量分配抗体、洗涤液、底物液等，保障试剂用量一致性。核心通过精准移液消除体积误差、更换吸头防控交叉污染，为实验重复性与结果准确性提供关键支撑。
 
方案详情：
一、实验原理
      猪繁殖与呼吸综合症病毒（PRRSV）分离与鉴定法，核心是 “先增殖再确认”。
分离原理：PRRSV 需寄生细胞，取病料（肺、血清等）处理后，接种 Marc-145 或猪肺泡巨噬细胞，37℃培养 3-7 天，病毒会利用细胞复制致细胞病变（CPE），未显 CPE 则盲传纯化。
鉴定原理：用特异性方法验证，如 IFA/IPMA 靠荧光 / 酶标 PRRSV 抗体结合抗原显信号，RT-PCR 将病毒 RNA 逆转录为 cDNA 后，用特异引物扩增（或测序）确认，排除其他病毒干扰。
二、‌实验准备
1、设配和材料
① Pipetty电动移液器MSIC01-03-250、MSIC01-02-1000及配套吸头；
② 二氧化碳培养箱（37 ℃）。
③ 冰箱（4 ℃、-20 ℃、-70 ℃）。
④ 倒置生物显微镜。
⑤ 恒温水浴箱（37 ℃）。
⑥ 离心机及离心管（规格 10 mL）。
⑦ 96 孔微量细胞培养板。
⑧ 组织研磨器。
⑨ 微孔滤器（滤膜孔径 0.22 um）。
 
2、试剂和材料
① 细胞生长液与维持液，。
② PRRSV 阳性血清或单克隆抗体。
③ 猪原代肺泡巨细胞（PAMs）或 MARC-145 细胞。
 
三、实验步骤
1、用 RPMI1640 细胞生长液稀释复苏的 PAMs，细胞终浓度为每毫升 1X10⁶个/ml， 细胞，或用DMEM 细胞生长液稀释 MARC-145 细胞，细胞终浓度为每毫升5X10⁴个细胞。然后，使用Pipetty电动移液器，设置连续分液模式，将稀释的细胞加入 96 孔细胞培养板中100 μL/孔，置于 37 ℃、5%二氧化碳培养箱中培养长成单层。
 
2、更换新吸头，在空白的 96 孔细胞培养板中加入细胞培养液 RPMI1640，90L/孔，在A排和E排各孔内分别加入制备好的样本，10 μL/孔（样本 1∶10 稀释，重复2孔），摇动培养板后，从 A排和E排孔各取10 μL，分别移入B排和F排孔内（样本1:100 稀释）。摇动培养板后，再从B排和F排孔各取 10 μL分别移入 C排和 G排孔内（样本1:1 000 稀释）。同样，再从从C排和G排孔各取 10 L，分别移入D排和 H 排孔内（样本1:10 000 稀释）。每个培养板应设置不接种样本的细胞空白对照。一般而言，对用于 PRRSV 分离的样本进行1:10和1:100稀释即可。
3、吸取稀释的样本 50 μL，接种于对应的细胞孔（第1代）中，吸附1h后，加入细胞维持液，100 μL/孔，置于 37 ℃、5%二氧化碳培养箱中培养，每天观察细胞病变，连续观察2d~5 d。
 
4、样本初次接种细胞培养2d后，不论有无 CPE，应将每孔内细胞液取 25 μL，移入按照 制备的新细胞板对应的孔内（第2代），置于 37 ℃、5%二氧化碳培养箱中培养 2d~5 d，每天观察 CPE。样本的细胞培养物应盲传 2代~3代。
5、用 PRRSV阳性血清或单克隆抗体，采用免疫过氧化物酶单层试验（IPMA）或间接免疫荧光试验（IFA），对出现细胞病变的培养物进行 PRRSV 的鉴定。
 
 
四、结果判定
1、PRRSV 感染细胞的 CPE 主要表现为细胞圆缩、聚集、固缩，最后崩解脱落。初次接种样本和盲传后均出现 CPE，或盲传后出现 CPE，并经 IPMA 或 IFA 检测为阳性，判定为 PRRSV 分离阳性。
2、初次接种样本和盲传后均无 CPE或出现 CPE 但经 IPMA 或 IFA 检测为阴性，判为 PRRSV 分离阴性。