斑马鱼活体荧光实时成像分钟级动态捕捉血栓形成与血管发育
2025-09-01 来源:本站 点击次数:48本研究成果由Yuta Imai, Satoru Ozaki, Taiki Noda, Isao Kobayashi, Kayo Sugitani, Satomi Kasashima, Eriko Morishita & Yuhei Araiso共同完成，论文题为《Real-time imaging of blood coagulation and angiogenesis during development in a zebrafish model of type I antithrombin deficiency》，于2025年5月发表在《Scientific Reports》。
重要发现
01基因编辑模型的建立与验证
研究团队通过CRISPR/Cas9系统靶向斑马鱼SERPINC1基因外显子1，成功构建了杂合子（zAT+/-）和纯合子（zAT-/-）突变体。基因测序显示突变导致5个碱基缺失（ACTTA）及单碱基插入（C），造成蛋白质框架移位和提前终止。Western blot检测证实，zAT-/-幼鱼血浆中AT蛋白表达量仅为野生型（zAT+/+）的2%，符合I型AT缺乏症的核心特征——蛋白分泌障碍。
借助双荧光标记和体视荧光显微镜技术，团队首次实现AT缺乏症中血栓形成的实时可视化观测：
血栓多样性：在8日龄幼鱼中，zAT+/-和zAT-/-组存活率均显著降低至88%。活体成像显示，突变体出现心脏内血栓、鳍血管（PFV）闭塞及后主静脉（PCV）血流中断，严重者甚至因全身血管栓塞死亡。
纤维蛋白沉积：免疫荧光染色证实，全身栓塞幼鱼的心脏周围血管存在显著纤维蛋白沉积，证明凝血级联反应的异常激活。
03血管发育延迟与代偿机制通过绿色荧光血管标记（Tg(fli1a:GFP)），团队发现AT缺乏仅短暂影响血管生成：
30小时关键期：zAT-/-胚胎的节间血管（ISV）形成率显著降低（65.8% vs 野生型82.0%），长度缩短约7%。
5日龄恢复：血管结构最终恢复正常，表明AT缺乏不影响血管最终形态，这与传统认知中AT的抗血管生成作用相悖。
基因表达分析进一步揭示生存关键：zAT-/-幼鱼通过上调纤溶酶原（PLG）基因促进血栓溶解，并下调凝血酶原（F2）基因减少凝血酶生成，形成独特的抗血栓代偿机制。
创新与亮点
01技术突破：活体血栓动态成像平台
本研究首次将CRISPR/Cas9基因编辑与双荧光标记活体成像技术结合，攻克了哺乳动物模型中胚胎致死的观测难题。通过荧光体视显微镜，实现了血栓形成、血管发育的分钟级动态捕捉，为凝血疾病研究提供了高时空分辨率的可视化工具。
突破性揭示斑马鱼幼鱼通过PLG/F2基因表达重编程抵抗高凝状态，这一发现解释了为何50%的zAT-/-个体可存活至成年（小鼠模型则100%胚胎致死）。该机制为人类先天性凝血障碍的代偿治疗提供了新靶点。
03模型价值：转化医学研究新范式
相比小鼠模型，斑马鱼具有胚胎透明性、繁殖高效性及凝血系统保守性三大优势。本研究建立的AT缺乏模型不仅能模拟人类疾病的血栓多样性，还可用于高通量药物筛选，加速抗凝疗法的临床转化。
总结与展望
本研究通过创新性基因编辑与活体成像技术，首次在斑马鱼模型中实现了I型AT缺乏症的血栓形成与血管发育实时观测，突破性地发现幼鱼通过PLG上调和F2下调的代偿机制存活。这一成果不仅为遗传性凝血疾病的机制研究提供了全新视角，其建立的实时成像平台更为抗血栓药物开发提供了高效工具。
未来研究方向包括：
1）深入解析PLG/F2基因调控的分子信号通路；
2）利用该模型筛选靶向代偿通路的小分子药物；
3）探索AT缺乏症中血管代偿与肿瘤血管生成的关联性。
随着技术的迭代，活体成像驱动的斑马鱼模型有望成为凝血疾病从机制研究到临床转化的核心平台，为精准医疗提供新引擎。
论文信息声明：本文仅用作学术目的。
Imai Y, Ozaki S, Noda T, Kobayashi I, Sugitani K, Kasashima S, Morishita E, Araiso Y. Real-time imaging of blood coagulation and angiogenesis during development in a zebrafish model of type I antithrombin deficiency. Sci Rep. 2025 May 27;15(1):18538.
DOI:10.1038/s41598-025-01658-z.