文章来源公众号：带你玩转规律中的逻辑 作者：时间旅行地图

一、认识抗体

（一）抗体的里程碑
中国早在11世纪的《痘疹定论》这部医书中的“种痘论”里的种痘法已不是原始的，而是相当进步的一种鼻苗法。一直到18世纪后的“牛痘”、白喉毒素治疗，再到20世纪对免疫系统产生的抗体化学性质的研究、结构的解析、模型的构建、以及多样性研究等，无一不证实人类对抗疾病的科学研究的重大历史进程的研究突破。

（二）抗体的结构
正因为有这些研究的累积和更新，才让我们认识到抗体主要是以“Y型”的结构形式存在的（后面会介绍其它类型的抗体，结构就不单纯是Y型）。

根据抗体的结构解析，将Y型抗体进行解构分析，得出如下信息。

一个完整的抗体包含重链和轻链的部分，其中重链用H（Heavy chain）表示，轻链用L（Light chain）表示。

对于链上的区域又分为可变区（Variable region，V区）和恒定区（Constant region，C区）。可变区之所以称之为可变区是因为发现其氨基端（N-末端）氨基酸序列变化很大；而恒定区则是因为其羧基端（C-末端）则相对稳定，变化很小。结合抗原的区域即发生在可变区。

（三）抗体的性质
抗体的化学性质是蛋白质。在木瓜蛋白酶处理下，Fab区域从抗体的结构上解离后单独形式存在；而在胃蛋白酶处理后，则2个Fab区域以二硫键的结合在一起存在，但重链的Fc区域则发生部分降解；有意思的是在还原剂存在的情况下，重链和轻链可以单独存在，这里主要是因为还原剂和二硫键之间产生的反应。

（四） 抗体的特性
抗体的产生离不开抗原对机体免疫系统的刺激以激活免疫系统应答而产生针对抗原的特异性抗体。这就是抗体的特异性。在展开抗体的特异性之前，我们先了解机体的免疫应答。

对于机体而言，当免疫的第一道和第二道屏障皮肤和粘膜都对抗原束手无策了。机体开启第三道免疫。

首先，病原（抗原）进入机体后先暴露病原体表面的特征性分子，然后被模式识别受体（PRR）结合，开启激活免疫级联反应途径。

其次是激活下游的信号通路，比如NF-κB等，从而导致IL-1、IL-12等促炎细胞因子的产生。

再者抗原提呈细胞（APC）吞噬抗原后将其降解为小分子抗原肽，在MHC分子的帮助下，呈递给T细胞。

最后，T细胞响应后，分化为不同的细胞亚群，调节免疫反应。而识别抗原的B细胞则在Th细胞的辅助下活化为浆细胞，由浆细胞产生针对抗原的特异性抗体，以中和清除抗原、激活补体和效应细胞。同时B细胞分化出记忆B细胞，以“记住”该抗原，待瑕疵同一种抗原刺激机体后，记忆B细胞立马分泌对应的抗体。

回到抗体的特异性上，抗体和抗原可以说是钥匙和锁的关系—一把钥匙开一把对应锁孔的锁，抗体也是一种抗体对应一种抗原的关系。

（五）抗体的种类
天然抗体有很多种，其中以IgA、IgD、IgE、IgM、IgG等5种的研究较集中。

IgA：有2种类型，血清型IgA1是单体形式；分泌性IgA2则是二聚体，存在于外分泌液中，初乳中的含量较高（这也是母乳喂养的因素之一）。占血清Ig含量约5-15%。

IgD：单体，属于B细胞表面膜结合型，是B细胞成熟的重要标志、抗原受体（BCR）。

IgE：单体，由呼吸道和胃肠道浆细胞产生。当机体发生过敏或寄生虫感染时水平增高。

IgM：五聚体形式存在，是个体发育过程中最早合成的，也是体液免疫应答最先产生的。当血清中IgM水平增加，意味着机体被病原感染了。

IgG：单体，有4种亚型（IgG1、IgG2、IgG3、IgG4），其中以IgG1含量最高。

正常机体血清中的含量占比：IgG > IgA > IgM > IgD > IgE。

半衰期：IgG (20-23 d) > IgA (~ 6 d) > IgM (~ 5 d) > IgD (3 d) = IgE (3 d)。

对于抗体，人们也可以根据具体的应用场景做抗体的改造。回顾下抗体的结构（上述第三张图），抗原结合区域CDRs是关键。因此，可以对抗体进行改造，如只针对肿瘤细胞而对正常细胞内外无影响的双特异性抗体，又如靶向某种疾病时在抗体Fc区域结合药物进行治疗的抗体偶联药物，再如为了提高免疫组化的组织渗透而降低背景信号的片段抗体等等。

而这些人为设计的抗体，都需要考虑到与抗体的亲和力、副作用等。除此之外还要考虑到具体的应用场景：是要设计为ATP抗体、pH依赖性抗体、表位抗体，还是要偶联抗体、阻断非特异性结合的片段抗体等等。

二、抗体的制备

（一）抗原
人类终生接触的抗原能达到上亿种，但不是所有的抗原都会引发机体产生抗体，因为还有皮肤和粘膜的两大防线。但，引发机体免疫的抗原也是不少，大体分为8大类。

（二）抗体的多样性

正因为抗原的多样性，所以要求机体产生的抗体也要多样性，毕竟一种抗体不能解决所有问题。那机体该如何解决抗体的多样性呢？

首先，要先了解人类免疫球蛋白基因库是包含数百个基因片段的：

重链（Heavy Chain）：VH（45-100个）、DH（23-30个）、JH（6-9个）；

轻链（Light Chain）：κ链：Vκ（30-40个）+ Jκ（5个）、λ链：Vλ（30个）+ Jλ（4个）；

根据排列组合，重链组合是100 × 30 × 9 ≈ 1.8 × 104（个），轻链组合是(Vκ×Jκ) + (Vλ×Jλ) ≈ (40×5) + (30×4) = 320（个）。

那么，重链和轻链的所有组合为：1.8×104×320 = 5.76×106（种）。即有百万种抗体。如果再考虑VDJ区域连接过程引入的随机性、体细胞碱基突变、抗原表位空间构象变化等，抗体是有上亿种的。

（三）抗体制备平台
既然了解到抗原的种类和抗体产生的多样性，那该如何制备抗体呢？不可能为了研究某一抗原就让人感染后让人产生抗体吧！毕竟，违背伦理。该如何解决抗体制备的问题呢？

这里，不得不提及抗体制备的3大平台：通过实验动物来实现抗体的制备。

每种技术平台针对性不同，可根据具体的应用和要求选择适合自己开发抗体的方式。

（四）获取抗原
我们都知道天然抗原是最佳选择用于免疫动物的—因其天然构象和修饰是人为改造所不能及的。然而，要想获取天然抗原就需要该种抗原稳定性好—不能因为人为纯化过程而改变构象或修饰，页需要该种抗原的量满足实验用量—过少的抗原无法满足实验重复、接种剂量等达不到实验目的。

因此，退而求其次，选择合适的抗原是关键。一般实验时的抗原归为两大类：小分子类和蛋白类。

小分子类：如多肽、多糖等，可通过人工合成或提取的方式获得。但是因该类抗原分子量小，单独存在时难以激活免疫系统，必须在具备抗原决定簇的载体蛋白作用下，才能激活免疫系统产生免疫应答和抗体。

这类分子与载体蛋白需要通过偶联的方式存在，才能更好的进入体内实验。与载体蛋白的偶联方式主要有3种，分别如下。
（1）巯基–SH介导多肽与载体偶联：cKLH载体蛋白与sulfo-SMCC的偶联；
（2）EDC或EDC/NHS介导多肽与载体偶联（氨基-羧基）；
（3）GA( Glutaraldehyde,戊二醛)介导多肽与载体偶联；

其中，以sulfo-SMCC的偶联方式为主。而偶联的本质是小分子的-NH2（氨基）等基团与载体蛋白在偶联剂的作用下，发生有机化学的亲核取代或加成反应。（关于偶联，在后续的二抗部分也会讲到）。

重组蛋白类：该类抗原需要通过基因工程的方式，分析与设计抗原的表位序列信息，通过体外表达系统表达出蛋白后，作为抗原注射到实验动物体内进行免疫。

常见的体外表达系统如下所示。

随着合成生物学的发展，无细胞蛋白质合成系统也越发盛行，感兴趣的可以搜索有关文献阅读，本文不再叙述。

（五）佐剂与免疫动物
有了抗原，是不是就能够直接进行免疫动物了？答案是否定的。因为，这里还需要介绍下免疫动物时需要的佐剂。

为什么要使用佐剂呢？在此之前，我们先以弗氏佐剂的制备作为引子。

福氏不完全佐剂（FIA）的制备：先称取羊毛脂 2g，放入无菌乳钵内，再用吸管吸取液体石蜡 4mL，加入放有羊毛脂的乳钵中，沿一个方向边滴加边研磨混匀。

福氏完全佐剂（FCA）的制备：在上述的福氏不完全佐剂中再逐滴加入卡介苗 1mL，沿一个方向边滴边研磨，使菌体完全分散乳化。

这里值得说下卡介苗，其实就是减毒牛型结核杆菌悬浮液制成的活菌苗。减毒活菌是能极大的引起机体免疫的。由此，可以看出，佐剂其实是增强免疫应答的。可是，在注射抗原的时候抗原也能因其免疫啊！因为单纯注射抗原往往难以诱导高水平抗体产生。所以，为了提高抗体效价，就需要通过增强B细胞的活化和增殖，促进动物体内产生高浓度的特异性抗体；为了缩短免疫周期，减少免疫次数；为了刺激免疫系统产生更多的记忆B细胞，从而使抗体在体内维持更长的时间；佐剂是必不可少的。

可以理解为佐剂是为了提高免疫原性的！（因为免疫原性越高，产生的抗体越好）。

对于免疫的动物。我们分2部分讲解：免疫动物的选择、和如何免疫动物。

首先，免疫动物的选择，一般选择鼠、或者兔子。而单克隆抗体则以小鼠品系BALB/c使用的最多。原因在于该品系小鼠是近交系，至少经过20代的同窝交配培育而成。同品系内所有个体都可追溯到起源于第20代或以后代数的一对共同祖先；基因纯合，同基因型，表型均一，遗传稳定，背景资料完整。多克隆抗体一般选择免疫兔子。兔通常用为肿瘤发生以及损伤和伤口愈合以及其他应用的有用研究模型，因其免疫范围更广，可以产生的抗体种类和数量则更多，选择性更多。

其次，免疫动物需要关注剂量、免疫部位和免疫周期。对于免疫剂量，首次免疫小鼠的剂量为每次50～400μg，大鼠为每次 100μg～1mg，兔为每次200μg～1mg。加强免疫剂量为首次剂量的 1/5～2/5。对于免疫部位，抗原注射途径可根据不同抗原及实验要求，选用皮内、皮下、肌肉、腹腔、静脉或淋巴结等不同途径进行免疫。一般多采用动物的背部、足掌、淋巴结周围、耳后等处皮内或皮下多点注射。对于免疫周期，一般第一次和第二次间隔10～20d，3次及以后间隔7～10d，加佐剂者应为2周左右。免疫的总次数一般为 5～8 次。

如果要制备高度特异性的抗血清，可选择用低剂量抗原短程免疫的方法；但如果想获得高效价的抗血清，则需要用大剂量抗原长程免疫方法。

（六）血清效价评估
在接入抗体发现3大平台之前，还需要对免疫的动物血清中产生的抗体效价进行评估，这是评判免疫动物效果的方式之一。常用的方法为间接ELISA。

采用间接ELISA进行效价评估时，动物的采血部位有小鼠等小型动物采用尾尖采血，单次取0.1mL血液；或眶后静脉丛采血（0.2-0.3mL）及下颌静脉采血。其它的如摘眼球取血或心脏取血等。

采集的血液可选择静置或离心的方式分离出血清。进行ELISA时选择PBS或者生理盐水进行10倍梯度稀释。以样本检出值/阴性对照值>2.1视为阳性标准，而此时稀释的血清倍数则为，比如稀释了320,000倍，其效价为1:320000。

至于抗原包被酶标板，可参考如下方法。

步骤一、 包被
物理吸附：利用酶标板材料聚苯乙烯与蛋白（pH9.6缓冲液）的疏水作用和静电吸附。
对象：抗体、重组抗原、病毒蛋白
化学偶联：利用化学交联剂EDC/NHS将蛋白的-NH2或-COOH与酶标板表面活性基团共价结合。
对象：小分子抗原（如短肽、激素）
蛋白浓度要求：1-10 μg/mL（浓度高造成多层吸附，浓度低信号弱）。
包被条件：50-100 μL/孔，4℃过夜

步骤二、封闭（BSA、脱脂奶粉、络蛋白，以防止非特异性结合）
1-5% BSA或5%脱脂奶粉（PBS配制）
100-200 μL/孔，37℃ 1-2 h，或4℃过夜。

步骤三、清洗，洗液：1×PBS（含1% Tween-20），清洗2-3次。

紧跟着就到了接3大抗体发现平台。

至于接的不同抗体发现平台的时间，一般杂交瘤平台选择末次免疫第3天，单B细胞平台免疫后7-14天（外周血记忆B细胞高峰期），噬菌体平台则在免疫后28-42天（加强免疫后14天建库）。

（七）二抗
继特异性的一抗后，二抗闪亮登场。从上述ELISA列表中，可以看出，不是所有的ELISA实验都需要二抗的，比如直接法，但这种直接标记一抗的情况往往会增加实验成本。为了解决这类问题，二抗诞生了—放大一抗的信号，让检测不再困难。

本文上面的第二张图表明抗体是可以根据实际目的进行人为改造的。那么对应的二抗也是有类似的原则。

那二抗既然是放大一抗的信号的，是否需要有什么标记来标记二抗，这样能够很好的检测抗体信号？这里需要提及一个问题，就是什么实验需要基于颜色（可见光或荧光）做标记来检测。具体需要的实验场景有WB、IHC、IF、FACS、ELISA等。

有哪些标记二抗的方法呢？主流的分为3种，分别是酶标法、生物素法、荧光法。这3种方法都离不开化学偶联剂。

首先，先说下酶标法。酶标法常用的酶以辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（ALP或AP）为主。

HRP常用底物为邻苯二胺（OPD）、四甲基联苯胺（TMB）、3,3'-二氨基联苯胺（DAB），其与TMB反应后变为蓝色，加入硫酸终止反应后变为黄色；与DAB反应后产生棕色沉淀。通过颜色变化可肉眼或光学显微镜下直接观察。

AP常用底物为对-硝基苯磷酸酯（p-NPP）、5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸酯（BCIP）/硝基蓝四唑（NBT）等，其与BCIP/NBT反应显蓝紫色。也可通过颜色变化肉眼或光学显微镜下直接观察。

上述二者与二抗的偶联，也是离不开偶联剂在中间行使功能的。当然也可以通过其它方法，比如通过基因工程融合的方法将ALP与抗体的Fc区域融合表达出天然ALP抗体。

在选择什么酶做标记方面：
HRP：灵敏度较高，价格低廉，性质稳定，但容易受到叠氮化钠、氰化物等抑制剂的影响。
AP：灵敏度一般高于HRP系统，空白值较低，但价格昂贵，制备结合物所得率较HRP低，且对温度和pH值较为敏感。
生物素法，则是有赖于生物素分子自身的化学性质决定的，如其含有的-NH2（氨基）、-SH（巯基）、CHO（醛基）等与偶联剂反应。

而亲和素和生物素之间有很强的作用，且一个亲和素可以结合4个生物素，可以将信号放大4倍。（这里不得不提一下Element Biosciences的亲和子测序，其亲和子也是通过亲和素实现的）小Tips：能否用于空间组学？

至于荧光法，可以直接通过点击化学的方式结合荧光基团，也可以通过NHS酯反应或马来先酰亚胺反应生成。

总结下有关抗体标记的信息。

应用到其它实验方面：
免疫沉淀/免疫共沉淀：生物素化抗体+链霉亲和素包被的磁珠/琼脂糖珠。
亲和纯化：生物素化抗体固定在链霉亲和素包被的层析柱上，用于纯化特定抗原。