DNA-PAINT的超分辨率显微技术原理和应用介绍
2025-11-11 来源:PCO sCMOS eBook 点击次数:140
By Alexander Auer & Ralf Jungmann
超分辨率1 技术使研究人员能够以前所未有的精度在光的经典衍射极限以下进行成像。在实施单分子定位的过程中，分子在非荧光暗状态（或关闭状态）和荧光亮状态（或开启状态）之间“切换”，以便以亚衍射的精度选定和检测它们的位置。通过获取不仅单张而是一整叠图像来构建超分辨率图像，其中在“开启状态”中只记录荧光分子的随机子集（每帧都各不相同）。
最近推出的超分辨率方法 DNA-PAINT2 基于瞬态 DNA-DNA 相互作用。与 STORM3、PALM4 或 GSDIM5 等其他随机方法相比，DNA-PAINT 技术中的荧光分子不会在暗态和亮态之间切换，所谓的“闪烁”是由短荧光 DNA 链与目标的瞬时杂交（结合和解除结合）产生的（图 1a）。一旦成像链结合到对接位点，荧光团就会被固定，并且可以被相机检测到。因为成像链是动态补充的，所以 DNA-PAINT 不会受到光漂白的影响，这允许在与对接位点结合时提取固定成像链的全部光子容量，从而促成低至几纳米的卓越分辨率6。高信号背景比使 DNA-PAINT 和共聚焦方法（如旋转圆盘共聚焦显微镜7）相结合成为可能。我们用合成的 DNA 纳米结构测试了一款新的非制冷型科学 CMOS 相机 (pco.panda 4.2 bi)。因此，我们装饰了一个扁平矩形 的DNA 折纸，其中 DNA-PAINT 对接位点呈网格状，间距为 10 nm（图 1b），并使用全内反射荧光8 (TIRF) 显微镜对表面结合结构进行成像。单个结合位点可以以大约 1.5 nm 的精度定位，即为显着的 FWHM 分辨率 ~3.6 nm（图 1c）。
由于 DNA-PAINT 中 DNA 相互作用的可编程性质，多色图像采集不仅限于光谱上的多重功能。一种称为 exchange-PAINT9 的方法，让使用同一种性能最佳的荧光染料来进行多重功能成像成为可能：成像链的 DNA 序列可以上伪色，其中每个正交序列代表一种独特的颜色，然后按顺序执行图像采集，可以使用洗涤缓冲液去除瞬时结合的成像链，并且可以引入新的“颜色”（例如具有不同序列的成像链）。
超分辨率1 技术使研究人员能够以前所未有的精度在光的经典衍射极限以下进行成像。在实施单分子定位的过程中，分子在非荧光暗状态（或关闭状态）和荧光亮状态（或开启状态）之间“切换”，以便以亚衍射的精度选定和检测它们的位置。通过获取不仅单张而是一整叠图像来构建超分辨率图像，其中在“开启状态”中只记录荧光分子的随机子集（每帧都各不相同）。
图 1：DNA 折纸的 DNA-PAINT 成像。(a) DNA-PAINT 原理：用荧光染料功能化的短寡核苷酸与位于靶标的互补 DNA 链（对接位点）瞬时结合。(b) 平面矩形 DNA 折纸用于 DNA-PAINT 成像，具有 4 x 4 网格图案装饰，间距 10 nm。(c) 用 DNA-PAINT 和 sCMOS 相机 (pco.panda 4.2) 成像的 n = 24 的DNA 折纸的总览图像。比例尺：20 nm (a)。
最近推出的超分辨率方法 DNA-PAINT2 基于瞬态 DNA-DNA 相互作用。与 STORM3、PALM4 或 GSDIM5 等其他随机方法相比，DNA-PAINT 技术中的荧光分子不会在暗态和亮态之间切换，所谓的“闪烁”是由短荧光 DNA 链与目标的瞬时杂交（结合和解除结合）产生的（图 1a）。一旦成像链结合到对接位点，荧光团就会被固定，并且可以被相机检测到。因为成像链是动态补充的，所以 DNA-PAINT 不会受到光漂白的影响，这允许在与对接位点结合时提取固定成像链的全部光子容量，从而促成低至几纳米的卓越分辨率6。高信号背景比使 DNA-PAINT 和共聚焦方法（如旋转圆盘共聚焦显微镜7）相结合成为可能。我们用合成的 DNA 纳米结构测试了一款新的非制冷型科学 CMOS 相机 (pco.panda 4.2 bi)。因此，我们装饰了一个扁平矩形 的DNA 折纸，其中 DNA-PAINT 对接位点呈网格状，间距为 10 nm（图 1b），并使用全内反射荧光8 (TIRF) 显微镜对表面结合结构进行成像。单个结合位点可以以大约 1.5 nm 的精度定位，即为显着的 FWHM 分辨率 ~3.6 nm（图 1c）。
由于 DNA-PAINT 中 DNA 相互作用的可编程性质，多色图像采集不仅限于光谱上的多重功能。一种称为 exchange-PAINT9 的方法，让使用同一种性能最佳的荧光染料来进行多重功能成像成为可能：成像链的 DNA 序列可以上伪色，其中每个正交序列代表一种独特的颜色，然后按顺序执行图像采集，可以使用洗涤缓冲液去除瞬时结合的成像链，并且可以引入新的“颜色”（例如具有不同序列的成像链）。
图 2：细胞环境中的 DNA-PAINT 成像。(a) 微管用 α 微管蛋白一抗和 DNA 偶联二抗标记。使用非制冷型 sCMOS 相机 (pco.panda 4.2) 在 TIRF 模式下进行成像。(b) 衍射限制 (DL) 表示和图 (c) a 中突出显示区域的超分辨率 (SR) 放大。(d)图 (c) 中标记区域的横截面直方图显示了三个微管中间纤维之间的距离。比例尺：5 μm (a), 500 nm (b, c)。
为了使用 DNA-PAINT 对细胞成分进行成像，标记探针（例如抗体 10、纳米抗体 11 或 Affimers12）与作为对接位点的短 DNA 寡核苷酸结合。我们研究了非制冷型 sCMOS 相机在固定 COS7 细胞的细胞环境中的成像能力，其中 α 微管蛋白用一抗和二抗标记（图 2）。概览（图 2a）显示了超分辨微管网络。图 2b 中衍射受限的放大面板与图 2c 中的超分辨率放大面板的对比清楚地显示了分辨率的增加，从而可以区分和测量单个微管蛋白纤维丝之间的距离（图 2d）。显然，非制冷型 sCMOS 相机非常适合使用 DNA-PAINT 方法进行此类超分辨率测量。
尾注：
1 Hell, S.W., et al., The 2015 super-resolution microscopy roadmap. Journal of Physics D-Applied Physics, 2015. 48(44).
2 Jungmann, R., et al., Single-molecule kinetics and super-resolution microscopy by fluorescence imaging of transient binding on DNA origami. Nano Lett, 2010. 10(11): p. 4756-61.
3 Rust, M.J., M. Bates, and X.W. Zhuang, Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods, 2006. 3(10): p. 793-795.
4 Betzig, E., et al., Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science, 2006. 313(5793): p. 1642-1645.
5 Folling, J., et al., Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return. Nat Methods 5 (2008), p. 943-945.
6 Dai, M., DNA-PAINT Super-Resolution Imaging for Nucleic Acid Nanostructures. Methods Mol Biol, 2017. 1500: p. 185-202.
7 Schueder, F., et al., Multiplexed 3D super-resolution imaging of whole cells using spinning disk confocal microscopy and DNA-PAINT. Nat Commun, 2017. 8(1): p. 2090.
8 Axelrod, D., Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence. J Cell Biol, 1981. 89(1): p. 141-5.
9 Jungmann, R., et al., Multiplexed 3D cellular super-resolution imaging with DNAPAINT and Exchange-PAINT. Nat Methods, 2014. 11(3): p. 313-8.
10 Schnitzbauer, J., et al., Super-resolution microscopy with DNA-PAINT. Nat Protoc, 2017. 12(6): p. 1198-1228.
11 Agasti, S.S., et al., DNA-barcoded labeling probes for highly multiplexed Exchange- PAINT imaging. Chem Sci, 2017. 8(4): p. 3080-3091.
12 Schlichthaerle, T., et al., Site-specific labeling of Affimers for DNA-PAINT microscopy. Angew Chem Int Ed Engl, 2018.
【关于埃赛力达科技Excelitas Technologies Corp.】
埃赛力达是一家技术经验丰富供应商，致力于提供先进的、改善生活的革新技术，为生命科学、先进工业、新一代半导体、航空航天等各终端市场的全球企业提供服务。公司总部位于美国宾夕法尼亚州匹兹堡。埃赛力达是光子技术设计、开发和制造领域的重要合作伙伴，为全球客户提供传感、检测、成像、光学和特种光源方面的前沿创新技术。
广州市元奥仪器有限公司作为埃赛力达在国内的一级代理商，根据用户的不同需求提供具备高性能、高质量的产品，为客户提供专业的方案，欢迎咨询！
为了使用 DNA-PAINT 对细胞成分进行成像，标记探针（例如抗体 10、纳米抗体 11 或 Affimers12）与作为对接位点的短 DNA 寡核苷酸结合。我们研究了非制冷型 sCMOS 相机在固定 COS7 细胞的细胞环境中的成像能力，其中 α 微管蛋白用一抗和二抗标记（图 2）。概览（图 2a）显示了超分辨微管网络。图 2b 中衍射受限的放大面板与图 2c 中的超分辨率放大面板的对比清楚地显示了分辨率的增加，从而可以区分和测量单个微管蛋白纤维丝之间的距离（图 2d）。显然，非制冷型 sCMOS 相机非常适合使用 DNA-PAINT 方法进行此类超分辨率测量。
尾注：
1 Hell, S.W., et al., The 2015 super-resolution microscopy roadmap. Journal of Physics D-Applied Physics, 2015. 48(44).
2 Jungmann, R., et al., Single-molecule kinetics and super-resolution microscopy by fluorescence imaging of transient binding on DNA origami. Nano Lett, 2010. 10(11): p. 4756-61.
3 Rust, M.J., M. Bates, and X.W. Zhuang, Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods, 2006. 3(10): p. 793-795.
4 Betzig, E., et al., Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science, 2006. 313(5793): p. 1642-1645.
5 Folling, J., et al., Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return. Nat Methods 5 (2008), p. 943-945.
6 Dai, M., DNA-PAINT Super-Resolution Imaging for Nucleic Acid Nanostructures. Methods Mol Biol, 2017. 1500: p. 185-202.
7 Schueder, F., et al., Multiplexed 3D super-resolution imaging of whole cells using spinning disk confocal microscopy and DNA-PAINT. Nat Commun, 2017. 8(1): p. 2090.
8 Axelrod, D., Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence. J Cell Biol, 1981. 89(1): p. 141-5.
9 Jungmann, R., et al., Multiplexed 3D cellular super-resolution imaging with DNAPAINT and Exchange-PAINT. Nat Methods, 2014. 11(3): p. 313-8.
10 Schnitzbauer, J., et al., Super-resolution microscopy with DNA-PAINT. Nat Protoc, 2017. 12(6): p. 1198-1228.
11 Agasti, S.S., et al., DNA-barcoded labeling probes for highly multiplexed Exchange- PAINT imaging. Chem Sci, 2017. 8(4): p. 3080-3091.
12 Schlichthaerle, T., et al., Site-specific labeling of Affimers for DNA-PAINT microscopy. Angew Chem Int Ed Engl, 2018.
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