Mechanical Stimulation of Equine Bone Marrow Mesenchymal Stromal Cell-Derived Cartilage-Like In Vitro Model Triggers Osteoarthritis Features

Keywords: chondrocytes; equine cartilage; in vitro model; mechanical compression; mesenchymal stromal cells; osteoarthritis.

骨关节炎（OA）是一种影响世界数百万人的普遍疾病，尤其是对人类和马匹的影响。这种衰弱性疾病的特征是不可逆的软骨退化、慢性炎症和关节功能的下降，由机械和生化因素驱动。机械负荷在软骨细胞调节的软骨稳态中起着至关重要的作用，并已被证明可以影响细胞行为。然而，损伤性负荷会对软骨产生不利影响。体外研究表明，过度压缩负荷与细胞死亡增加（包括细胞坏死和凋亡）、蛋白聚糖的释放，以及细胞外基质（ECM）的退化有关。

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软骨细胞是软骨中的主要细胞类型，主要通过整合素-基质相互作用、机械敏感离子通道的激活（如瞬时受体电位香草素（TRPV）通道或 Piezo-通道）以及初级纤毛诱导的信号传导感知和响应机械负荷。间充质基质细胞（MSCs）也可以感知机械刺激（MS），特别是通过 TRPV4，这会影响 ECM 稳态和组成。

动物模型，包括小型和大型动物的自发性和诱导性 OA，对于评估 OA 新兴治疗方法的治疗潜力至关重要。大型动物模型，如马，在解剖结构上与人类相似，对于研究 OA 进展和改进治疗特别有价值。基于此，法国卡昂诺曼底大学联合研究实验室BIOTARGEN UR7450团队的一项研究利用马骨髓间充质基质细胞（BM-MSC）构建体外OA模型，对 MSC 衍生的软骨细胞施加压缩力，并评估细胞感知 MS 的能力以及 MS 对细胞活力、ECM 组成和关节软骨标志物表达的影响。研究成果发表于 ACS Biomaterials Science & Engineering 期刊题为“Mechanical Stimulation of Equine Bone Marrow Mesenchymal Stromal Cell-Derived Cartilage-Like In Vitro Model Triggers Osteoarthritis Features”。

首先，研究人员通过将马 BM-MSCs 接种在胶原蛋白海绵并在软骨培养基中培养构建了软骨样体外模型（图1 A）。然后比较了MSCs、MSCs衍生的软骨细胞和马关节软骨分离的软骨细胞中TRPV4的转录水平。有趣的是，MSCs向软骨细胞的分化诱导 TRPV4 水平增加 100 倍（图1 B）。为了确认MSCs来源的软骨细胞可以感知机械刺激（MS），软骨样体外模型在静态条件下或以 2.5 kPa、0.2Hz的压缩幅度进行 MS 15 分钟（图1 A）。正如预期，实验观察到 MS 下，P44/42 MAPK 的磷酸化比静态条件下增加（图1 C）。这些发现表明，MSC 衍生的软骨细胞表达机械敏感离子 TRPV4 通道，并且可以将 MS 整合到细胞内信号中。

图1    马 BM-MSC 衍生的软骨细胞表达 TRPV4 并感知机械刺激。

下一步是研究压缩是否影响细胞活力。为此，将马骨髓间充质基质细胞衍生的软骨细胞用EdU（一种胸腺嘧啶类似物，检测细胞增殖情况）孵育。令人惊讶的是，与静态条件相比，MS（D24）下3天后EdU 阳性细胞的数量减少（图2 A、B）。与对照组相比，增殖细胞核抗原（PCNA）蛋白含量明显降低（图2 C）。因此，MS后3天和7天，细胞核数/mm2 略有下降（图2 F）。同时，进行了 TUNEL 测定评估对细胞凋亡的影响。无论在对照条件下还是在MS下，凋亡核的比例都很低，持续3天（D24）或7天（D28）（图2 D、E）。此外，通过损伤细胞向培养基中释放腺苷酸激酶来测量，无论持续时间如何，MS都不会诱导细胞毒性。这些发现表明，MS 对马MSC来源的软骨细胞可减少细胞增殖，而不影响细胞死亡或凋亡。

图2   机械刺激减少马 BM-MSC 衍生的软骨细胞增殖。

接下来，实验试图确定 MS 是否与在软骨样体外模型中诱导骨关节炎特征相关。在施加MS后，研究了编码ECM成分和关键转录因子的基因的mRNA水平以及ECM的质量。在静态条件下培养的软骨样体外模型在D21和D24/D28天之间的ACAN、COL2A1、SOX9、PRG4、COL1A1和RUNX2 mRNA  水平没有统计学差异，COL2A1/COL1A1 比值没有变化，但COMP的mRNA水平在D24时降低。相反，经历MS后，与D21相比，COL2A1、SOX9、PRG4和RUNX2 mRNA水平升高，COL1A1保持不变，COL2A1/COL1A1比值升高，COMP 水平相似。

为了研究软骨样体外模型中ECM的质量，使用Western blot 分析评估了胶原蛋白的水平，在加压 3 天后（D24），与静态条件下相比，MS 条件下 I 型胶原蛋白和 IIB 型胶原蛋白的含量较低，7天后（D28）I型和IIB型胶原蛋白的数量急剧减少（图3 A）。因此，软骨样体外模型的MS导致部分ECM成分的mRNA水平增加，但未在蛋白水平上反映出来。

同时进行了组织学分析，使用不同的染色方法可视化ECM。在 21 天时，软骨样体外模型充满新合成的 ECM，并在海绵中均匀分布（图3 B）。事实上，与中心相比，在外围观察到更高的染色强度。无论培养条件如何，软骨样体外模型都没有表现出明显的骨化迹象，因为茜素红染色仍然很弱。MS 3 天后（D24），与静态条件相比，GAG（糖胺聚糖）和胶原蛋白含量减少。加压 7 天后（D28），ECM 含量的减少变得更加明显，特别是 II 型胶原蛋白（图3 B、C）。

这些发现表明，MS 通过减少软骨样体外模型中的 GAG 和胶原蛋白量来损害 ECM 的质量，而不会降低主要 ECM 成分的 mRNA 水平。

图3    机械刺激会损害 ECM 成分的积累。

最后，实验研究了分解代谢的增加是否会引发MS时 ECM 的改变。促炎细胞因子在诱导分解代谢过程中起着重要作用。在测试的 23 种细胞因子中，只有 3 种达到检测阈值。静态条件下，成纤维细胞生长因子2（FGF-2）、粒细胞集落刺激因子（G-CSF）和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）水平均低于检测阈值。然而，在机械压缩下，这三种细胞因子的浓度显著增加，表明MS诱导FGF-2，G-CSF和GM-CSF的释放或表达增加。

在OA期间参与蛋白聚糖降解的主要聚集酶ADAMTS5的mRNA水平在MS 3天后增加了约50倍（D24），并且这种趋势在7天后持续（D28）（图4 A）。此外，还研究了 HtrA1，一种已知在 OA 中发挥多种作用的丝氨酸蛋白酶，向减少和受损的ECM聚集。评估显示，MS 3 天后HtrA1 蛋白水平升高，并持续到7天后（图4 B）。同样，MS 3 天后 MMP 活性升高（图4 C），说明基质酶参与观察到的反应。

鉴于软骨样体外模型ECM 的蛋白聚糖/GAG含量较高，其降解可能导致其释放到培养基中，因此测量了培养基中GAG的水平。在静态条件下（从第24天到第28天）GAG浓度似乎随着时间的推移而增加。一个周期的MS（D21）不影响培养基中的GAG浓度（图4 D）。相反，MS 在 3 天（D24）和 7 天（D28）后诱导 GAG 和 COMP 浓度升高（图4 D、E）。一氧化氮（NO）是 OA 中的关键炎症介质。由于NO在溶液中不稳定，会迅速转化为亚硝酸盐，因此测定了培养基中亚硝酸盐的浓度，发现亚硝酸盐浓度在加压 3 天和 7 天后显著增加（图4 F）。

这些发现表明，MS 可以增加马 BM-MSC 衍生软骨细胞的炎症介质并促进分解代谢，从而促进 ECM 降解。

图4    马 BM-MSC 衍生软骨细胞的机械刺激促进分解代谢相关事件。

图5    图形概要

总之，这项研究强调了机械刺激与软骨代谢之间的复杂关系，表明机械应力可以在源自 BM-MSCs 的软骨样体外模型中诱导骨关节炎特征，如炎症介质、ECM 下调和蛋白酶上调。此外，这些结果强调了软骨模型中控制机械负荷的重要性，因为过度压缩可以模拟 OA 等关节疾病中出现的退行性变化。许多机械传感器位于细胞表面，包括初级纤毛、各种离子通道（如 TRPV4 和 PIEZO）以及整合素，将机械信号转化为细胞内信号，这取决于机械刺激的大小，并且可以被周围的微环境调节。此外，机械刺激可以直接或间接促进修饰ECM的蛋白酶的上调，从而释放各种影响细胞行为的因子。因此，未来需要进一步的研究来充分阐明将机械刺激与软骨样模型中的骨关节炎特征联系起来的机制。

参考文献：Contentin R, Jehl C, Commenchail K, Legendre F, Galéra P, Cassé F, Demoor M. Mechanical Stimulation of Equine Bone Marrow Mesenchymal Stromal Cell-Derived Cartilage-Like In Vitro Model Triggers Osteoarthritis Features. ACS Biomater Sci Eng. 2025 Jul 14;11(7):4153-4165. doi: 10.1021/acsbiomaterials.5c00500. Epub 2025 Jun 13. PMID: 40512481; PMCID: PMC12264857.
原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40512481/

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