近年来随着基因治疗持续发展，使得业界对慢病毒载体（Lentiviral vectors，LVs）规模化、低成本的纯化工艺产生了浓厚兴趣。目前，实验室规模普遍采用超速离心法对慢病毒进行纯化。虽然可获得高浓度慢病毒，但存在明显局限性比如稳定性差，长时间处理会导致部分载体失活；残留杂质可能引发非预期效应或降低疗效；回收率低且难以放大等。

慢病毒是一种直径80-120 nm的对称球形包膜病毒，由包膜蛋白、包膜、基质蛋白、衣壳、两条单链RNA、逆转录酶、整合酶和蛋白酶组成。在基因治疗领域，慢病毒因其高效转导和长期表达的特性成为递送基因的“明星工具”。

慢病毒下游纯化工艺三大难点

1.病毒脆弱，活性难保
慢病毒像“娇贵的泡泡”，纯化过程中容易因剪切力、压力变化、溶液pH和盐浓度波动导致失活。
慢病毒稳定性差，初期研究发现，澄清后的慢病毒样品在室温静置保存2小时后活性滴度会下降约20%。

2.杂质难除，安全存忧
慢病毒在收获时，细胞活率较低，慢病毒培养上清中混杂着宿主细胞分泌的蛋白质（HCP）和DNA（HCD），传统方法难以彻底清除。
慢病毒与游离DNA通过电荷相互作用^[5]、空间位阻效应^[6]可以形成大颗粒复合物，进一步影响杂质的去除。

3.下游纯化，收率低
慢病毒收获液浊度较高，滤膜容易堵塞，澄清时回收率低。
经电镜实测慢病毒的直径在80-120 nm之间，且容易形成＞200 nm的大颗粒，导致在除菌过滤时回收率较低。


Cytiva Fast Trak破解之道

1. 突破稳定性瓶颈
温和且快速的纯化工艺：Hollow Fiber因为条件温和，剪切力低，对于自身稳定性差的慢病毒较为友好，所以选用Hollow Fiber对慢病毒进行浓缩/换液。Cytiva的Capto Core 700层析为流穿模式，在保证杂质去除能力的前提下工艺时间更短，Capto Core 700层析回收率可以达到90%。
选择适合的缓冲液：不要使用高盐或极端pH缓冲液可以有效避免病毒颗粒解体。另外可以添加蔗糖或者葡萄糖等作为保护剂，保护病毒结构。

2. 增强杂质去除力
酶切条件优化：在慢病毒纯化工艺中使用核酸酶对收获液进行酶处理以降解各种形式的DNA和RNA，从而达到去除样品中核酸的目的。同时考虑到工艺经济性的问题，对全能核酸酶的酶切浓度、温度和时长进行了优化。优化后酶处理工艺可以降解99%以上的HCD。
复合模式层析：Cytiva的Capto Core 700为复合模式层析填料，表层是具有一定孔径的钝化层，慢病毒等大于700 kDa的大分子可以经过外水直接流穿。较小的分子如RNA片段、HCP和内毒素片段等经过小孔进入内核，与微球内的配基吸附结合，可以实现慢病毒和杂质的分离。


3.提高病毒回收率
澄清工艺：采用Hollow Fiber进行澄清具有低剪切力的优势，选用0.65 μm的中空纤维柱进行澄清。在澄清工艺中特别是对透过通量进行了研究，从图4中可以看到透过通量保持稳定，工艺过程中跨膜压也较低。经优化，澄清步骤回收率显著提高。
除菌过滤：为提高慢病毒除菌过滤工艺的回收率，一方面可进行滤器筛选，另一方面对滤器载量和过滤速度进行优化。优化后除菌过滤的慢病毒回收率可达到80%，大大提高了下游纯化工艺的整体回收率。
层析填料介绍


Cytiva（思拓凡）——Capto Core 700 多模式层析填料
产品详情
Capto™ 填料基于坚硬的高流动性琼脂糖基架，具有优化的孔隙结构，可提供良好的压力和流动性。这种填料旨在用于工艺开发和大规模制造，但也用于研究实验室。它们的高流速可提高生产率和大批量加工能力。
Capto Core系列填料为双层设计，表层是具有一定孔径的钝化层，它可以排阻大分子，使之流穿。小分子通过表层进入填料内部核心，核心层可以结合杂质分子。这一设计使得该系列填料具有分子排阻和吸附层析的双重特点。该系列填料的优点包括高载量、高流速、短保留时间、在宽操作窗口内保持强大性能、工艺设计简单和生产效率高。
新型核心层析技术和多模式、辛胺配基赋予 Capto Core 700 多模式层析填料双功能。具有分子排阻和结合特性。
产品优点：
· 新型核心层析技术和多模式、辛胺配基赋予 Capto Core 700 多模式层析填料双功能，具有分子排阻和结合特性。
· 新型核心层析技术可高效捕获污染物，同时在流穿过程中收集靶分子。
· 与标准分子排阻（凝胶过滤）方法相比，显著提高了生产率并提高了流速。
· 通过流穿层析法和稳定的性能进行直接优化。
· 使用预填充 HiTrap 和 HiScreen 层析柱进行便捷的小规模纯化、工艺开发和规模扩大。
· 填料可满足供应安全、性能稳定和监管支持方面的工业需要。
污染物的多模式去除：
Capto Core 700 多模式层析填料由配基活化核心和惰性外壳组成。惰性外壳不允许大分子（临界值约为 Mr 700000）通过外壳的孔进入核内。在层析柱流穿过程中收集这些较大分子，而较小杂质与内化配基结合。
疏水性、带正电荷的配基：
Capto Core 700多模式层析填料内核配基具有疏水性同时带正电荷，从而可对小至足以进入核心的各种污染物进行高效多模式结合。多模式配基可确保在较宽的 pH 值和盐浓度范围内与大多数杂质强结合。通过使用 NaOH 和可在大多数情况下使用的溶剂进行的原位清洁 (CIP) 程序，从填料中去除结合的杂质。
规模放大较为简单：
HiTrap 和 HiScreen 层析柱可串联连接以增加载量，并且在开发高效且可靠的分离方法时可方便使用。

在基因治疗产业化的关键赛道上，慢病毒载体的高效纯化是决定技术转化与临床应用的核心环节，而“高亲和性”与“广谱适应性”则是层析填料破解纯化难题的核心诉求。传统纯化工艺面临的病毒失活、杂质残留、收率不足等痛点，本质上呼唤着兼具精准靶向、稳定兼容与规模化潜力的填料解决方案。

Cytiva（思拓凡）推出的Capto Core 700多模式层析填料，正是这一需求的理想应答者。其基于双层结构设计与辛胺配基的创新组合，既凭借疏水性与正电荷的多模式结合特性，实现了对HCP、HCD、内毒素等各类杂质的高亲和捕获，又以700 kDa的分子排阻临界值，为慢病毒等大分子载体提供了广谱适配的流穿分离路径，完美契合“高亲和、广适应”的核心要求。同时，温和的工艺条件保障了病毒活性，优化后的澄清、除菌过滤流程与填料的高流速、高载量优势，共同实现了回收率与生产效率的双重提升，更兼顾了从实验室研发到工业规模化生产的无缝衔接。