切向流过滤（TFF）和尺寸排阻色谱（SEC）是两种常用于从复杂生物流体中富集外泌体的方法。结合这些著名的技术（它们是温和的外泌体纯化方法），可以去除大部分宿主细胞蛋白（HCP）和DNA。此外，这种工作流程回收率高，并能最大限度地减少纯化外泌体生物活性的损失。

已知在不同培养基和条件下培养的不同细胞类型所产生的外泌体，会呈现出不同的糖基化模式和表面蛋白——这不仅会影响其生物活性，还会影响外泌体与过滤膜和层析树脂的相互作用。我们为三种细胞系开发了一种温和且可扩展的工作流程，并在思拓凡的羊水细胞生产细胞（CAP™）的结果进行了评估：

在该工作流程中，使用了Cytiva的羊膜细胞生产（CAP™）细胞系来生产外泌体，这些外泌体表面有与CD63相连的绿色荧光蛋白（GFP）标签，用于荧光检测。为了确定TFF-SEC方案的可重复性，对GFP-外泌体CAP™条件培养基上清进行了两次独立的富集，先采用TFF，再通过superSEC树脂进行纯化。与实施例1相同，进行了两种规模的纯化——两个HiScreen™柱，以及一个床高为20厘米的HiScale™ 26/40柱，详见材料和方法中的表1。对回收率和外泌体浓度进行了测量，包括颗粒数（NTA）、CD63（ELISA）、总蛋白和单链DNA含量分析。通过蛋白质印迹（Wb）和扫描电子显微镜（SEM）对收集到的组分中的颗粒进行了最终鉴定确认。

将250毫升CAP™ CCS的样品负荷施加到TFF中空纤维膜（截留分子量750 kDa）上，进行过滤。TFF步骤后收集了25毫升样品。大约97%的DNA和92%的蛋白质被去除。根据纳米颗粒跟踪分析（NTA），TFF后保留的颗粒产量为初始颗粒浓度的56%。通过CD63酶联免疫吸附试验（ELISA）分析，外泌体回收率为43%。

然后将TFF保留物上样到色谱柱中——1毫升上样到HiScreen™ superSEC色谱柱，15毫升上样到HiScale™色谱柱。色谱图如图7所示。490纳米吸光度曲线显示，GFP外泌体在两种色谱柱形式中均在第一个峰中洗脱出来，且在第二个峰中未检测到490纳米吸光度。HiScreen™和HiScale™ superSEC色谱柱的运行时间分别为20分钟（流速129厘米/小时）和45分钟（流速45厘米/小时）。算上色谱柱的平衡和清洗时间，一次运行的总时间分别为1小时和2小时。

HiScale™层析柱运行结果证实，外泌体和蛋白质污染物也能在更大规模下实现分离。切向流过滤（TFF）过程中的核酸酶处理是有效的，且能改善宿主DNA的去除效果——采用核酸酶处理的TFF步骤后，外泌体样品中97%的DNA残留被去除，而未使用核酸酶时仅能去除40%。superSEC树脂纯化步骤进一步提高了外泌体组分中DNA的去除率，这证实superSEC可作为外泌体纯化第二步的有效替代方法。纳米颗粒追踪分析（NTA）还显示，在整个过程中，颗粒的平均尺寸（150至160纳米）没有变化。

为进一步确认所收集的组分中存在外泌体，我们使用CD81和TSG101抗体进行了蛋白质印迹（Wb）分析，并通过扫描电子显微镜（SEM）进行了电镜分析。蛋白质印迹结果证实，这些囊泡表达CD81和TSG101，不过TSG101仅在切向流过滤（TFF）截留物中被检测到，这可能是由于体积排阻色谱（SEC）组分中的浓度较低。

扫描电镜分析图像显示存在具有典型杯状形态的囊泡，且TFF-SEC流程去除了杂质。

综上，TFF与SEC工艺的组合凭借温和性、高效除杂能力、高回收率、良好可扩展性及对生物活性的保留优势，成为外泌体纯化的优选方案，完美契合外泌体功能研究、临床应用及规模化生产的核心需求。思拓凡（Cytiva）已成功将该工艺应用于CAP™细胞系产生的GFP外泌体纯化，通过实际应用验证了其在不同规模下的稳定性与可靠性。随着外泌体技术在生物医学领域的深入发展，TFF+SEC组合工艺将持续为各类细胞系来源外泌体的高效纯化提供有力支撑，推动外泌体从实验室研究走向更广泛的临床转化与产业化应用。