本文要点：近红外二区（NIR-II）比率荧光成像在精准识别转移性淋巴结（MLNs）方面具有巨大潜力，但其生物相容性探针设计仍面临组成简化与光谱可调性广泛的挑战。本研究开发了一种基于同源Ag₂Se量子点（QDs）的极简自校准比率探针。通过合理设计三丁基膦介导的配位动力学，实现了935–1710 nm范围内连续的尺寸依赖性发射调控，并系统阐明了合成机制与结构-性能的关系。低毒性的Ag₂Se核心结合聚（氨基酸）包覆，确保了优异的生物安全性，经体外细胞毒性与体内生化检测验证。两种光谱差异显著的量子点（发射峰分别为1040 nm和1305 nm，半高宽为176 nm和119 nm）可实现多路解剖成像，支持术中实时检测与术后评估MLNs，诊断阈值比率约为0.9。本工作提出了一种可扩展的全NIR-II单色量子点合成策略，并建立了一种组分极简的生物相容性平台，用于精准比率诊断。

方案1. 调整Ag2Se量子点中的NIR-II覆盖率，用于MLN的比率检测

本研究通过用短链三丁基膦（TBP）替代传统TOP，理性重构了Ag₂Se量子点（QDs）的合成体系，TBP具有更低的空间位阻和更强的Ag⁺配位能力，协同OT动态调控生长动力学。通过系统优化反应温度、TBP/Ag比例及Se/Ag化学计量比，阐明了反应的尺寸调控机制，实现了全NIR-II光谱覆盖（935–1710 nm，方案1A）。随后，选取了两组光谱分离良好的Ag₂Se QDs，其发射峰分别位于1040 nm（S-QD，半高宽=176 nm）和1305 nm（L-QD，半高宽=119 nm），成功实现了血管-淋巴管、血管-胃肠道及单纯淋巴结构的活体双色成像。进一步将S-QD功能化修饰叶酸靶向基团，并与非靶向L-QD整合，构建了同源比率探针用于精准转移性淋巴结（MLNs）检测，其诊断阈值低于1（方案1B）。本研究为精准调控单波长发射Ag₂Se QDs提供了指导，建立了跨量子点体系的光谱调控框架，拓展了其在MLNs检测中的生物医学应用，推动了组分极简、高安全性、高性能比率探针的发展。

图1. 不同Ag2Se量子点发射的调控和表征

考虑Ag₂Se量子点的尺寸依赖特性，可通过调控其尺寸扩展发射范围。在经典合成方法中，通常通过控制反应温度及Se-TOP复合物与乙酸银的摩尔比来实现。然而，叔膦（PR₃，如TOP）的作用常被低估。近期研究表明，PR₃可与Ag⁺配位形成Ag-(PR₃)ₓ络合物，其配位强度各不相同。因此，研究者推测，此前Ag₂Se量子点发射范围窄、半高宽（FWHM）大的原因，可能源于Ag-TOP配位较弱，导致解离-成核动力学失衡，限制了颗粒成熟并影响其发光特性。采用更具反应活性的PR₃可改变合成动力学，获得尺寸更大、FWHM更小的Ag₂Se量子点。基于三丁基膦（TBP）较短的烷基链，其因空间位阻减小和更强的σ-给电子能力，显著增强了与Ag⁺的配位能力，通过多参数调控策略（涉及TBP含量、反应温度及Se/Ag摩尔比）系统建立了Ag₂Se量子点的结构-性能关系（图1a）。图1b–g展示了在不同反应时间（1–80 min）及条件下获得的Ag₂Se量子点的荧光光谱，以及其发射峰位置（图1h–j）和FWHM的相应变化。

图2. Ag₂Se量子点性质表征

为阐明结构-性能关系，选取发射波长分别为1030、1150、1300、1390、1520、1660和1710 nm的Ag₂Se量子点（QDs）进行系统表征（图2a）。高分辨率透射电子显微镜图像显示，所有样品的晶格间距均为0.24 nm，与正交相Ag₂Se的(013)晶面（JCPDS 24–1041）高度吻合，证实了晶体结构的均一性。统计分析表明，Ag₂Se量子点尺寸随发射波长从2.53 nm增至6.2 nm（图2b）。由于强电子限域效应，即使微小的尺寸变化也会导致显著的发射波长偏移（≈700 nm）。此外，颗粒均匀性与光谱半高宽（FWHM）高度相关，验证了此前观察到的光学行为。吸收光谱显示，随着量子点尺寸增大，激子吸收峰持续红移，表明带隙减小（图2c）。值得注意的是，当尺寸接近≈7.2 nm（图2d）时，NIR-II发射变得不可检测，这归因于带隙收窄及带内跃迁的出现。这些结果表明，Ag₂Se量子点在7 nm以下表现出显著的量子限域效应，可实现全NIR-II波段的可调发射（图2e）。通过Tauc图计算的光学带隙范围为0.69至1.31 eV，并采用经验拟合公式（公式1）描述该NIR-II波段内尺寸依赖的光学特性（图2f）：

结合上述合成策略与结构-性能关联，研究者提出了一种改进的Ag₂Se量子点形成机制。如图2g所示，实线与虚线分别代表Ag前驱体浓度与量子点尺寸的时序演化。绿色区域为Se-TBP前驱体注入前阶段，随后为快速成核阶段（黄色）和生长阶段（红色）。尽管较高温度与增大Se/Ag比均能加速成核与生长，但其作用机制略有不同：温度主要通过调控前驱体反应性影响最终颗粒尺寸，而Se/Ag比则主要影响早期成核过程。在其他条件相同的情况下，增加TBP含量（如从0.8 mmol增至1.6 mmol）可使样品呈现相似的初始生长速率，随后进一步增大尺寸，这归因于TBP对Ag₂Se的逐步溶解，提升了有效Ag浓度并促进后续生长。上述三个参数协同调控成核与成熟动力学。通过优化这些因素，成功获得了发射波长从935 nm至1710 nm可调的Ag₂Se量子点（图2h）。进一步测量了绝对量子产率（PLQY），结果显示其随发射波长增加而逐渐降低，在1400 nm以上低于1%，这可能源于较大颗粒引入了更多表面缺陷。为实现比率检测，需选用两种光谱分离的量子点以供光谱仪与成像系统清晰区分。综合考虑亮度，选取了中心发射波长分别约为1040 nm和1330 nm的两种Ag₂Se量子点，其对应PLQY的局部最大值。如预期，仅通过切换光学滤光片（SP1150和LP1290）并采用单一808 nm连续激光激发，即可明确区分二者信号，为实际应用奠定了基础。

图3. S-QD和L-QD血管淋巴双色成像

为实现活体成像，亟需具备高生物相容性的水分散型探针。聚（氨基酸）因其相较于聚醚酰亚胺、聚丙烯酸、聚乙二醇（PEG）和聚乙烯吡咯烷酮（PVP）等传统聚合物更优异的生物相容性、可生物降解性及更低的免疫原性，近年来备受关注。然而，其在稳定Ag₂Se量子点方面的应用仍属空白。为此，本文合成了疏水性油胺接枝的聚琥珀酰亚胺（PSIOAm），其在碱性条件下水解可生成两亲性油胺接枝的聚天冬氨酸。利用该配体，两种光谱可区分的Ag₂Se量子点成功转移至水相，分别标记为S-QD（≈1040 nm，短波长量子点）和L-QD（≈1305 nm，长波长量子点）（图3a）。动态光散射（DLS）测量显示，S-QD和L-QD的流体动力学直径分别为≈31 nm和≈48 nm，且二者ζ电位均接近−38 mV，表明其具有优异的胶体稳定性。S-QD和L-QD展现出卓越的光稳定性：在808 nm连续激光照射30分钟后，其荧光强度仍保持初始值的≈90%，而吲哚菁绿（ICG）的荧光强度则降至40%以下，凸显了Ag₂Se量子点在长时程NIR-II成像中的优越稳定性。接着在1%脂乳仿体中进一步评估其深层成像能力，S-QD（采集波段900–1150 nm）的散射和背景信号高于L-QD（1290–1700 nm），但其更高的亮度补偿了这些影响，使二者均实现了≈6 mm的成像深度。

如图3b所示，仅通过切换滤光片（SP1150和LP1290），即可在混合样品中准确区分S-QD和L-QD信号。细胞毒性通过MTT实验（和活/死细胞染色）评估。S-QD和L-QD均表现出低细胞毒性，在4T1细胞中分别于200 µg mL⁻¹和300 µg mL⁻¹浓度下仍维持超过90%的细胞活力。活/死染色图像进一步佐证了上述结果：孵育12和24小时后，红色染色的死细胞极少，表明细胞活力极高。这些结果证实了聚（氨基酸）包覆的S-QD和L-QD具有低细胞毒性。

在S-QD浓度为0.4 mg mL⁻¹、L-QD浓度为0.6 mg mL⁻¹时，溶血率均低于5%，证实其具有良好的血液相容性。研究者首先按照图3c所示方案进行了双色血管-淋巴管成像。由于较长的发射波长可实现更深的组织穿透和更高的信背比（SBR），L-QD经静脉注射用于高分辨率可视化微血管网络。如图3d所示，该通道可清晰区分体内两条相邻的小血管，其宽度分别为0.39 mm和0.47 mm（图3e）。短波长发射的S-QD用于淋巴结（LNs）成像。进一步的多通道融合图像揭示了血管与淋巴结的空间关系，其中一处共定位的1.87 mm淋巴结与相邻的血管（宽度分别为0.46 mm和0.8 mm）清晰可辨（图3e），这种解剖细节水平是单色成像无法实现的。该双色平台亦被拓展至胃肠道成像（图3f）。线剖面分析显示肠管宽度约为3.25 mm，SBR为1.6（图3g）。为最大化双色探针应用价值，开展了淋巴结的多路复用与比率成像（图3h）。将尺寸匹配的S-QD与L-QD共注射至小鼠足垫，可高效共定位至骶淋巴结（图3i）。令人振奋的是，建立SP1150/LP1290信号比率模型有效消除了背景干扰（比率=0.93），将淋巴结检测精度从融合图像中的2.3 mm提升至比率伪彩图像中的1.95 mm（图3j）。这种自校准技术有望为精准转移性淋巴结（MLNs）成像建立新范式。

图4. 荷瘤小鼠和正常小鼠MLNs的比率检测

为实现转移性淋巴结（MLNs）的比率检测，将S-QDs功能化修饰叶酸（SQD-FA），靶向4T1肿瘤细胞表面过表达的叶酸受体（图4a）。共轭成功通过傅里叶变换红外（FTIR）光谱验证：尽管PSIOAm与FA-PEG-NH₂均显示酰胺键（≈1600 cm⁻¹），SQD-FA在1100 cm⁻¹处出现新的C-O-C伸缩振动峰，为FA-PEG偶联提供了直接证据（图4b）。流体动力学直径由31 nm增至37 nm，ζ电位由−38 mV升至−18 mV，进一步证实了有效的表面修饰。细胞摄取研究显示，与非靶向S-QDs相比，4T1细胞孵育SQD-FA后NIR-II荧光显著增强，验证了叶酸受体介导的内吞作用（图4c）。为评估探针在体内的性能，将SQD-FA与L-QD共注射形成比率对（Mix-QD）用于MLNs检测（图4d）。理论上，两种量子点通过淋巴引流相似积累，在正常淋巴结（NLNs）中维持稳定的SP1150/LP1290强度比。而肿瘤浸润的MLNs则因主动靶向优先滞留SQD-FA，导致比率显著升高。为验证此机制，通过足垫注射建立4T1-Luc转移模型，生物发光成像在2周内确认淋巴结转移（图4e）。对生物发光淋巴结、正常淋巴结及肿瘤组织的组织学检查（H&E染色）显示MLNs呈现肿瘤样形态（图4f）。此外，Ki67免疫染色表明MLNs中增殖信号呈弥散分布（接近原发肿瘤），而正常淋巴结中Ki67表达微弱且局域化（图4f），共同确认了其转移状态。这些发现证实了生物发光检测识别淋巴转移的可靠性。有趣的是，利用L-QDs的NIR-II成像揭示了MLNs中的血管重塑：与正常淋巴结中单根血管（≈0.55 mm）相比，MLNs内血管更密集、更迂曲（0.52–0.76 mm）（图4g,h），可能促进探针的增强递送。

为评估诊断性能，在荷瘤与对照小鼠中进行动态成像与比率重建（图4i）。尽管合并荧光图像无法区分MLNs与NLNs，伪彩色比率图却能清晰分辨MLNs。定量分析显示，所有淋巴结中两个通道的信号均呈时间依赖性增强。在NLNs中，SQD-FA与L-QD的强度曲线高度一致（图4j），均在≈30 min达峰（分别为初始强度的1.29倍与1.31倍），证实其药代动力学行为相似。在MLNs中，两种探针的时序趋势与NLNs一致（图4k），同样在≈30 min达峰，但荧光增强更显著（SQD-FA为2.4倍，L-QD为1.7倍），这可能源于血管密度增加与叶酸受体介导的归巢效应。尽管绝对荧光强度存在部分不一致，比率信号在时间上保持高度稳定，有效校正了个体强度差异。比率在MLNs中稳定升高至≈1.41，而NLNs中始终低于1（图4l），证明该比率策略对MLNs识别具有高灵敏度与高特异性。

图5. 同一小鼠体内MLN和正常LN的比率成像

为进一步验证比率成像策略的诊断可靠性与可重复性，研究者在同一只动物体内对转移性淋巴结（MLNs）与对侧正常淋巴结（NLNs）进行了配对检测。选取三只单侧携带MLNs的小鼠，注射SQD-FA/L-QD探针混合物（图5a）。30分钟后，采集双通道荧光信号并处理生成伪彩色SP1150/LP1290比率图（图5b）。所有受试动物中，MLNs的比率值均显著高于正常淋巴结（比率>1.4 vs <1），差异具有统计学意义（p<0.01，n=3），表明其具有稳健的组内对比度与良好的可重复性。为验证体内结果，对术中切除的淋巴结进行离体分析。生物发光成像确认了MLNs的成功切除（图5c），而NIR-II荧光成像保留了体内观察到的比率对比度（图5d）。值得注意的是，离体成像消除了组织散射伪影，提供了更清晰的对比度，差异高度显著（p<0.001，n=3）。在不同深度测量的比率信号显示，体内较深淋巴结（≈2–3 mm）与离体表浅淋巴结（0 mm）的比率读数均能可靠区分淋巴结状态，证实该比率法有效最小化了影响单色成像的深度依赖性衰减。形态学上，MLNs明显肿大，投影面积约为正常淋巴结的四倍（图5e），符合病理性淋巴结肿大的特征。综上，这些结果证实了比率成像平台在实时术中识别与术后病理评估MLNs方面的高准确性、可重复性及双模态转化潜力。本探针利用MLNs与NLNs的摄取差异，在体内外均提供清晰对比。可激活策略（如酶或pH响应设计）有望进一步提升特异性，是未来优化本比率平台的有前景方向。

为全面评估体内生物相容性，分别在静脉和口服给药后开展了急性和长期毒性研究，发现量子点清除高效且长期滞留极少。注射后24小时，处死小鼠并进行血液学、生化及组织病理学分析。QD处理组与对照组在关键血液学参数上无显著差异（n=3，图5f），包括白细胞计数（WBC）、淋巴细胞计数（Lymph）、红细胞计数（RBC）、血红蛋白（HGB）、红细胞压积（HCT）、平均红细胞体积（MCV）、平均红细胞血红蛋白含量（MCH）、平均红细胞血红蛋白浓度（MCHC）和血小板计数（PLT），所有数值均在生理范围内，表明系统毒性可忽略。同样，血清生化指标未显示肝肾功能损伤迹象（图5h），主要器官的H&E染色未见凋亡、炎症或结构异常（图5i），进一步证实低急性毒性。QD处理组小鼠的体重变化轨迹与生理盐水对照组全程一致（图5j），表明无延迟性不良反应。综上，这些结果证实了多路复用Ag₂Se量子点优异的体内生物相容性，与体外结果一致，并凸显其临床转化的广阔潜力。

综上，本研究通过以低空间位阻的TBP替代传统TOP，构建了Ag₂Se量子点的理性合成策略，协同OT精准调控颗粒生长动力学。该配体工程策略实现了对量子点尺寸与发射的精确调控，首次覆盖了整个NIR-II窗口（935–1710 nm），为Ag₂Se量子点迄今最宽的光谱调控范围。基于此可调发射特性，选用光谱互不干扰的S-QD（1040 nm）与L-QD（1305 nm）实现了血管、淋巴系统及胃肠道的双色活体成像。在此双发射框架基础上，通过将S-QD功能化修饰叶酸以实现主动靶向，同时保留L-QD作为内参，构建了组分同源的比率成像平台。该系统基于约0.9的比率阈值，可靠地区分了转移性淋巴结（MLNs）与正常淋巴结（NLNs），在术中与术后场景中均展现出卓越的灵敏度、可重复性与稳健性。本研究为Ag₂Se量子点的光谱工程与生物医学应用开辟了新范式，为开发低毒性、多路复用的临床诊断探针提供了坚实框架。

参考文献

Ge W, Gao B, Li S, et al. Self‐Calibrated Identification of Metastatic Lymph Nodes Using Full‐NIR‐II Tunable Ag2Se Quantum Dots Engineered by Short‐Chain Phosphines[J]. Small, 2025, 21(50): e10056.

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