摘要
特应性皮炎以慢性炎症、屏障功能障碍和瘙痒为特征，搔抓等外界刺激会加重上述症状。

2024年11月，九州大学医学研究生院皮肤科的Takeshi Nakahara等研究团队在《International Journal of Molecular Sciences》期刊上发表了题为“Extracellular ATP Contributes to Barrier Function and Inflammation in Atopic Dermatitis: Potential for Topical Treatment of Atopic Dermatitis by Targeting Extracellular ATP”的研究。该研究探讨了细胞外三磷酸腺苷在特应性皮炎病理生理中的作用，并评估了ATP释放抑制剂氯膦酸盐对特应性皮炎的药物潜力。

研究表明，细胞外ATP会降低角质形成细胞中丝聚合蛋白的表达，而丝聚合蛋白是维持皮肤屏障完整性的关键蛋白，因此细胞外ATP会损害皮肤屏障功能。此外，白细胞介素-4和机械刺激会触发ATP释放，进而促进免疫细胞产生细胞因子和趋化因子，加剧炎症反应。氯膦酸盐可通过抑制ATP释放，恢复角质形成细胞中的丝聚合蛋白水平，减少树突状细胞产生胸腺活化调节趋化因子，并改善特应性皮炎小鼠模型的症状。这些发现表明，靶向细胞外ATP有望成为改善特应性皮炎皮肤屏障功能和减轻炎症的新研究策略。未来研究应进一步探索靶向ATP在临床场景中的长期疗效与安全性。

研究材料与仪器
材料
细胞、ATP、IL-4、氯膦酸盐、MC903、荧光素-荧光素酶试剂、TRIzol试剂、RNeasy Plus Micro Kit、PrimeScript RT 试剂试剂盒、TB Green Premix Ex Taq、鼠源CCL17/TARC ELISA试剂盒、中性福尔马林、乙醇、Dulbecco氏磷酸盐缓冲液

实验动物：8周龄雌性C57BL/6小鼠

仪器
荧光素-荧光素酶检测相关设备、DTX 800多模式检测仪、CFX Connect实时荧光定量PCR检测系统、数字卡尺、苏木精-伊红染色相关设备、ASCH VAPOSCAN经皮水分流失测量仪、GraphPad PRISM 5软件。 

ASCH VAPOSCAN经皮水分流失测量仪

实验过程
体外实验
1. 细胞培养：正常人类表皮角质形成细胞在添加牛垂体提取物、重组人表皮生长因子等成分的KGM-Gold培养基中培养，待细胞融合度达70%–80%时传代，取第三代细胞进行后续处理。分离C57BL/6小鼠骨髓细胞，在含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的RPMI-1640培养基中培养，第10天收集非贴壁细胞，通过CD11c免疫磁珠阳性分选获得纯度95%–97%的骨髓来源树突状细胞。

2. 体外角质形成细胞划痕模型建立：将正常人类表皮角质形成细胞接种于6孔板，待细胞形成完整单层后，用1000μL移液枪头划痕，划痕后孵育15分钟用于检测细胞外ATP，孵育24小时用于荧光定量PCR检测。

3. 细胞外ATP浓度测量：收集细胞培养上清液，离心后取上清，加入荧光素-荧光素酶试剂，通过化学发光法检测ATP浓度。

4. 荧光定量PCR检测：提取细胞或小鼠耳部皮肤组织的总RNA，反转录合成cDNA，采用TB Green Premix Ex Taq进行实时荧光定量PCR，检测丝聚合蛋白、TARC及各类细胞因子的mRNA表达水平。

5. 酶联免疫吸附试验：收集骨髓来源树突状细胞培养上清液，使用鼠源CCL17/TARC ELISA试剂盒检测TARC蛋白含量。

体内实验
1. 尘螨抗原诱导的小鼠特应性皮炎模型建立：将小鼠分为对照组、特应性皮炎组、特应性皮炎+氯膦酸盐组。特应性皮炎组和特应性皮炎+氯膦酸盐组小鼠双耳涂抹含MC903的乙醇溶液，5小时后特应性皮炎+氯膦酸盐组涂抹氯膦酸盐溶液，特应性皮炎组涂抹溶媒；对照组涂抹乙醇。连续5天上述处理后，两组均每日涂抹对应试剂至第10天。

2. 小鼠耳部厚度测量：每日使用数字卡尺测量小鼠耳部厚度，记录变化情况。

3. 组织学检查：取小鼠耳部皮肤，用10%中性福尔马林固定、石蜡包埋、切片，进行苏木精-伊红染色，观察表皮厚度和真皮内炎症细胞浸润情况，统计炎症细胞数量和表皮厚度平均值。

4. 经表皮失水量测量：使用ASCH VAPOSCAN经皮水分流失测量仪，在标准温湿度环境下测量小鼠皮肤病变部位的经表皮失水量。

使用Vapo Scan仪器在第0、2、4、6天测量病灶处 TEWL

5. 统计分析：所有数据以均值±标准误表示，采用单因素方差分析结合Bonferroni多重比较检验分析组间差异，P＜0.05视为差异有统计学意义。

结论
细胞外ATP会降低角质形成细胞中丝聚合蛋白的表达，损害皮肤屏障功能；IL-4和搔抓等机械刺激会促进角质形成细胞、树突状细胞释放ATP，进而加剧特应性皮炎的炎症反应。而氯膦酸盐可通过抑制囊泡核苷酸转运蛋白来阻断ATP释放，能够恢复IL-4或搔抓导致的丝聚合蛋白表达下降，减少树突状细胞产生TARC。外用氯膦酸盐可改善尘螨抗原诱导的特应性皮炎小鼠模型的耳部肿胀、红斑、鳞屑等症状，降低表皮厚度和炎症细胞浸润程度，改善皮肤屏障功能。靶向细胞外ATP有望成为特应性皮炎研究新方向，既能改善慢性症状，也可能缓解由外界刺激引发的急性加重症状。