黑色素瘤是一种极具侵袭性的肿瘤，起源于黑色素细胞，分为皮肤型、肢端型和黏膜型等亚型。免疫检查点抑制剂（ICIs，以单克隆抗体为主的抗癌药物），可显著改善黑色素瘤晚期患者的预后。更有多项临床研究表明，通过联用靶向肿瘤血管新生过程的抗血管生成治疗，可将客观缓解率从0%至23.3%提高至 45% 至 48.3%。然而，一部分黑色素瘤患者对该治疗仍无响应，需要寻找其他有效的生物标志物以优化患者分层并降低ICIs相关风险。

细胞外囊泡（EVs）是由原始细胞分泌的小型膜结构（直径 30-1000 纳米）。它们携带生物活性分子，经体液在局部扩散或远距离传播，由蛋白质-蛋白质相互作用与靶细胞结合，从而影响肿瘤的进展和转移。对于黏膜型黑色素瘤，其细胞外囊泡的蛋白质谱及与免疫治疗的关联目前尚未明确。
文章题目为“Dynamic Change of PD-L2 on Circulating Plasma Extracellular Vesicles as a Predictor of Treatment Response in Melanoma Patients Receiving Anti-PD-1 Therapy”于2025年2月发表在Journal of Extracellular Vesicles杂志（IF：16.7），作者来自于北京大学肿瘤发生与转化研究教育部重点实验室。

作者以32例黏膜型黑色素瘤晚期患者为发现队列，接受抗PD-1抑制剂特瑞普利单抗联合抗血管生成抑制剂沃利替尼治疗，收集治疗前的30份血浆样本和治疗4周后的29份血浆样本，用于筛选潜在生物标志物、构建预测模型，以及评估疾病预后、治疗疗效等相关指标。同时，68例黑色素瘤其他不同亚型的同期患者为验证队列，接受抗PD-1单药治疗，收集治疗前的68份血浆样本和治疗后的67份血浆样本，用于验证发现队列中筛选出的标志物 / 构建的模型是否具有稳定的预测效能，评估其准确性和重复性。

通过英国ArrayJet微阵列生物芯片点样仪，作者将45种蛋白抗体点印于三维修饰的玻片表面，制备成检测EVs的蛋白芯片。采用尺寸排阻色谱法（SEC）纯化血浆和细胞培养上清中的 EVs。随后，用含5%牛血清白蛋白（BSA）的磷酸盐缓冲液（PBS）封闭芯片1小时，继而加入10 μL 经 0.05% PBST按 1:10 稀释的EV样本，孵育过夜。结束后，对蛋白芯片进行洗涤，依次加入生物素标记的EV抗体、Cy3 标记的链霉亲和素进行蛋白芯片杂交反应。最后采用荧光生物芯片扫描仪获取荧光信号和数据分析（研究流程如下图1）。
 
蛋白芯片结果显示：在治疗前（基线状态），无论治疗应答情况如何，患者间的细胞外囊泡（EV）膜蛋白表达水平存在显著差异，部分患者呈现高表达特征（图 2a）。治疗后，细胞外囊泡的膜蛋白表达水平呈上升趋势（图 2b、c）。上述结果提示膜蛋白表达水平变化与接受抗 PD-1 联合抗血管生成治疗的疗效具有相关性。

为分析血浆细胞外囊泡蛋白与临床应答的关系，研究人员将患者分为临床受益组与临床非受益组。其中，最佳治疗应答为部分缓解（PR）或疾病稳定（SD）的患者归入临床受益组，最佳治疗应答为疾病进展（PD）的患者归入临床非受益组。按不同时间点，对比了两组患者基线至治疗后蛋白表达水平的变化幅度，各时间点排名前十的差异蛋白详见（图2d）。

基线时，临床受益组患者血浆细胞外囊泡上的TIGIT与PD-L2 蛋白表达水平显著低于临床非受益组。治疗4周后，临床受益组患者细胞外囊泡上的HLA-ABC、CD39 及 HSP70 蛋白表达水平显著高于临床非受益组，且前者的细胞外囊泡 PD-L1 蛋白表达水平在数值上亦更高。因此，细胞外囊泡上的TIGIT、PD-L2、HLA-ABC、CD39、PD-L1 及 CD226 蛋白，均与黏膜黑色素瘤患者接受抗 PD-1 联合抗血管生成治疗的临床应答具有相关性。  
最后，作者分析了血浆细胞外囊泡表面 PD-L1 与 PD-L2 的表达水平，和患者无进展生存期及总生存期的关联性。研究发现，细胞外囊泡 PD-L1 的倍数变化值 FC≥1（治疗后表达水平与基线表达水平的比值≥1，反映蛋白表达的动态变化趋势） 组与 FC<1 组患者，在无进展生存期和总生存期上均无显著差异。但细胞外囊泡 PD-L2 的 FC≥1 组患者，无进展生存期较 FC<1 组显著延长，同时，FC≥1 组患者的总生存期也长于 FC<1 组。这是由于治疗诱导肿瘤微环境免疫活化，EV 分泌 PD-L2 代偿性上调导致的。

结论和意义：PD-L2+EVs 通过抑制 CD8 T 细胞活化、促进肿瘤生长，揭示了 PD-L2+EVs 存在时肿瘤对抗 PD-1 治疗更敏感的独特现象，确定了循环EV膜上 PD-L2 的动态变化可作为黑色素瘤患者基于 ICIs 治疗（包括抗 PD-1 联合抗血管生成治疗、抗 PD-1 单药治疗）反应和生存的潜在筛选生物标志物，有助于筛选出最可能从 ICIs 治疗中获益的患者，优化治疗决策，减少无效治疗和治疗相关不良事件的发生，为黑色素瘤的精准免疫治疗提供了重要的临床参考依据。

原文链接：https://doi.org/10.1002/jev2.70054

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