dCas9（dead Cas9）是 Cas9 蛋白的突 变 体， 即 因 Cas9 的 RuvC1 和 HNH 两个核酸酶活性区域同时发生突变产生，其剪切酶活性丧失，只保留了由 gRNA 引导进入基因组的能力。目前，CRISPR/dCas9 系统已被广泛应用于基因调控、 基因组成像、表观遗传调控等方面。

p-dCas9 蛋白 RuvC1 ( D10A ) 和 HNH ( H841A ) 结构域突变，核酸酶功能丧失

dCas9 和普通 Cas9 的核心区别

dCas9 系统能用来干什么？

dCas9 本身只是 “定位器”，真正强大的是给它接上各种功能蛋白，形成一套工具系统。

1. 基因抑制：CRISPRi

dCas9 可以结合目标基因组 DNA 序列，产生空间位阻，阻止其他 DNA 结合蛋白（如内源性转录因子和 RNA 聚合酶 II）的活性，从而干扰基因表达（CRISPR interference，CRISPRi）。在细菌中，使用基于 dCas9 的 CRISPRi 方法可以高效抑制基因表达，特异性高、脱靶率低， 并且可以利用多个 sgRNAs 同时控制多个基因。在哺乳动物细胞中，将 dCas9与强阻遏复合物如 Kruppel 相关盒融合会诱导其产生更强及更特异性的转录抑制。与 Cas9 诱导的永久性基因修饰不同，CRISPRi 对基因的抑制是可逆的。

2. 基因激活：CRISPRa

CRISPR 介导的基因激活称为 CRISPRa（CRISPR activation），利用 dCas9 融合蛋白招募转录激活因子，dCas9 与大肠杆菌聚合酶的 ω- 亚基融合，可将全酶组装在目标启动子上，用于转录激活。在哺乳动物细胞中，将dCas9 与 VP64 或 p65 激活域（p65AD）融合可以在仅一条 sgRNA 引导条件下同时激活报告基因和内源性基因。

3. 基因位点示踪：活细胞 DNA 成像

dCas9 带上荧光蛋白（如 GFP、mCherry），可以实时观察特定染色体区域在细胞内的位置，或者研究端粒、着丝粒、异染色质动态等。

4. 表观遗传修饰

dCas9 连接DNA 甲基化酶 / 去甲基化酶、组蛋白乙酰化 / 去乙酰化酶，可以实现精准表观编辑，不改变序列，只改变表达状态。

5. 染色质互作研究

dCas9 结合生物素标记、 proximity labeling 等，用来抓与靶位点相互作用的DNA、RNA、蛋白。