分离和培养兔外周血巨噬细胞的操作步骤介绍
2026-04-17 来源:本站 点击次数:205
兔外周血巨噬细胞的分离与培养是免疫学研究中的常见实验操作，其过程需结合密度梯度离心、差速贴壁和细胞因子诱导等技术，以获得高纯度、活性良好的原代细胞。
一、分离步骤
采血与抗凝处理
从健康兔耳缘静脉或心脏采集外周血，立即加入含抗凝剂（如肝素或EDTA）的采血管中，轻柔混匀，防止凝血。
密度梯度离心法分离单个核细胞
将抗凝血用等体积PBS稀释后，缓慢叠加于淋巴细胞分离液（如Ficoll-Paque，比重1.077）上层。
在4℃条件下，2000 rpm离心20分钟（无刹车），收集中间乳白色云雾层（即单个核细胞层）。
吸取界面细胞至新管，用PBS洗涤2次，每次250×g离心10分钟，去上清。
差速贴壁法富集巨噬细胞
将细胞重悬于含10%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培养基中，调整密度为5×10⁵ cells/mL。
接种至T25培养瓶或6孔板，置于37℃、5% CO₂培养箱中静置2小时。
此时单核细胞已初步贴壁，而淋巴细胞等悬浮细胞仍漂浮，轻轻吸去未贴壁细胞，保留贴壁细胞。
细胞因子诱导分化
加入含M-CSF（巨噬细胞集落刺激因子）的完全培养基，继续培养5–7天。
M-CSF可促进单核细胞向成熟巨噬细胞分化，期间每2–3天更换新鲜培养基。
二、培养条件与维护
培养基：推荐使用兔外周血巨噬细胞专用完全培养基（如CM-Rb037），或自配RPMI-1640 + 10% FBS + M-CSF + 青霉素/链霉素
培养环境：37℃、5% CO₂、饱和湿度
换液频率：每2–3天半量换液一次，避免扰动细胞
细胞状态：呈贴壁生长，形态为不规则多角形或伪足状，具典型巨噬细胞特征
三、传代与消化
该细胞为终末分化细胞，不增殖，传代仅用于转移或扩充分布。
消化时禁用胰酶（易损伤细胞），建议使用12 mM利多卡因消化液处理1–3分钟，待细胞变圆后加完全培养基终止消化，轻吹混匀后接种
四、质量控制
纯度检测：可通过CD68免疫荧光染色鉴定，纯度可达90%以上
无菌检测：确保无支原体、细菌、真菌及病毒污染（如HIV-1、HBV、HCV等）
活性检测：台盼蓝染色法测定活率，应>90%
注意事项：
所有操作需在生物安全柜中进行，严格无菌。
细胞仅限科研使用，不得用于临床治疗或诊断
收到冻存细胞后，应尽快复苏并放入培养箱静置3–4小时以恢复状态
一、分离步骤
采血与抗凝处理
从健康兔耳缘静脉或心脏采集外周血，立即加入含抗凝剂（如肝素或EDTA）的采血管中，轻柔混匀，防止凝血。
密度梯度离心法分离单个核细胞
将抗凝血用等体积PBS稀释后，缓慢叠加于淋巴细胞分离液（如Ficoll-Paque，比重1.077）上层。
在4℃条件下，2000 rpm离心20分钟（无刹车），收集中间乳白色云雾层（即单个核细胞层）。
吸取界面细胞至新管，用PBS洗涤2次，每次250×g离心10分钟，去上清。
差速贴壁法富集巨噬细胞
将细胞重悬于含10%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培养基中，调整密度为5×10⁵ cells/mL。
接种至T25培养瓶或6孔板，置于37℃、5% CO₂培养箱中静置2小时。
此时单核细胞已初步贴壁，而淋巴细胞等悬浮细胞仍漂浮，轻轻吸去未贴壁细胞，保留贴壁细胞。
细胞因子诱导分化
加入含M-CSF（巨噬细胞集落刺激因子）的完全培养基，继续培养5–7天。
M-CSF可促进单核细胞向成熟巨噬细胞分化，期间每2–3天更换新鲜培养基。
二、培养条件与维护
培养基：推荐使用兔外周血巨噬细胞专用完全培养基（如CM-Rb037），或自配RPMI-1640 + 10% FBS + M-CSF + 青霉素/链霉素
培养环境：37℃、5% CO₂、饱和湿度
换液频率：每2–3天半量换液一次，避免扰动细胞
细胞状态：呈贴壁生长，形态为不规则多角形或伪足状，具典型巨噬细胞特征
三、传代与消化
该细胞为终末分化细胞，不增殖，传代仅用于转移或扩充分布。
消化时禁用胰酶（易损伤细胞），建议使用12 mM利多卡因消化液处理1–3分钟，待细胞变圆后加完全培养基终止消化，轻吹混匀后接种
四、质量控制
纯度检测：可通过CD68免疫荧光染色鉴定，纯度可达90%以上
无菌检测：确保无支原体、细菌、真菌及病毒污染（如HIV-1、HBV、HCV等）
活性检测：台盼蓝染色法测定活率，应>90%
注意事项：
所有操作需在生物安全柜中进行，严格无菌。
细胞仅限科研使用，不得用于临床治疗或诊断
收到冻存细胞后，应尽快复苏并放入培养箱静置3–4小时以恢复状态
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