兔外周血巨噬细胞的传代步骤详解
2026-04-17 来源:本站 点击次数:187
兔外周血巨噬细胞属于终末分化细胞，不具有增殖能力，因此“传代”并非用于扩增，而是为了将细胞转移至新的培养器皿中以维持实验连续性或进行分装。由于其对胰酶敏感，常规消化方法易造成损伤，需采用特殊处理方式。
传代步骤如下：
观察细胞状态
待细胞贴壁生长至80%–90%汇合度时即可进行传代操作。倒置显微镜下观察，确认细胞形态正常、无污染。
弃去旧培养基
吸出T25培养瓶中的原培养液，避免扰动贴壁细胞层。
PBS清洗
加入5–6 mL无钙镁离子的PBS缓冲液，轻轻晃动培养瓶清洗1–2次，以去除残留血清及代谢物，随后吸弃。
使用利多卡因消化
加入1 mL 12 mM利多卡因消化液，轻旋培养瓶使液体均匀覆盖瓶底。
置于37℃培养箱中温浴1–3分钟，期间可在显微镜下观察细胞形态变化。
当多数细胞回缩变圆、边缘翘起时，立即终止消化。
终止消化并收集细胞
迅速加入5 mL完全培养基终止消化反应。
用移液枪轻柔吹打瓶壁数次，使细胞完全脱落，形成均匀悬液。
离心与重悬（可选）
将细胞悬液于1000 RPM离心8–10分钟，弃上清。
加入适量新鲜完全培养基重悬细胞沉淀，调整密度后接种至新培养瓶或实验器皿中。
补液与培养
按1:2至1:5比例分瓶，每瓶补加5–6 mL完全培养基。
放入37℃、5% CO₂、饱和湿度的培养箱中静置培养，2–3天更换一次培养基。
传代步骤如下：
观察细胞状态
待细胞贴壁生长至80%–90%汇合度时即可进行传代操作。倒置显微镜下观察，确认细胞形态正常、无污染。
弃去旧培养基
吸出T25培养瓶中的原培养液，避免扰动贴壁细胞层。
PBS清洗
加入5–6 mL无钙镁离子的PBS缓冲液，轻轻晃动培养瓶清洗1–2次，以去除残留血清及代谢物，随后吸弃。
使用利多卡因消化
加入1 mL 12 mM利多卡因消化液，轻旋培养瓶使液体均匀覆盖瓶底。
置于37℃培养箱中温浴1–3分钟，期间可在显微镜下观察细胞形态变化。
当多数细胞回缩变圆、边缘翘起时，立即终止消化。
终止消化并收集细胞
迅速加入5 mL完全培养基终止消化反应。
用移液枪轻柔吹打瓶壁数次，使细胞完全脱落，形成均匀悬液。
离心与重悬（可选）
将细胞悬液于1000 RPM离心8–10分钟，弃上清。
加入适量新鲜完全培养基重悬细胞沉淀，调整密度后接种至新培养瓶或实验器皿中。
补液与培养
按1:2至1:5比例分瓶，每瓶补加5–6 mL完全培养基。
放入37℃、5% CO₂、饱和湿度的培养箱中静置培养，2–3天更换一次培养基。
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