文献基本信息

文献题目：Absolute quantification of prokaryotes in the microbiome by 16S rRNA qPCR or ddPCR

期刊：Nature Protocols
影响因子：17.0（2023 年）
发表日期：2025 年在线发表
发表团队：斯坦福大学医学院（Ami S. Bhatt 团队）

核心价值：提供一套用于人类粪便样本中原核生物绝对定量的标准化实验方法，用 16S rRNA qPCR 或 ddPCR技术，实现粪便样本中原核生物的绝对定量。

研究背景：为什么要做「绝对定量」？
目前绝大多数微生物组研究只报相对丰度，
但它有明显缺陷：

• 无法反映样本真实的微生物载量
• 容易掩盖菌群总量的巨大差异
• 低生物量样本极易被稀释偏差误导

而绝对定量可以：

• 校正相对丰度带来的组成偏倚
• 直接给出每克粪便的细菌 / 古菌数量
• 可与临床表型、药物干预、疾病状态强关联
• 支持已测序样本回溯分析，无需重新测序

这篇 Protocol 的目标，就是让普通分子生物学实验室也能轻松做绝对定量。

研究方法
研究采用标准化流程，从冻存粪便样本开始，经试剂盒提取 DNA 并测定含水率校正湿重 / 干重；通过梯度稀释处理样本后，选用 16S rRNA qPCR（SYBR Green 法）或ddPCR（探针法）进行绝对定量，全程设置阴性 / 阳性提取对照、NTC、NIST 标准品及技术重复等严格质控，确保结果准确可靠。
 

研究结果

1. 一致性高
   在有效定量范围内，qPCR 与 ddPCR 结果平均偏差仅 1.25 倍，高度吻合。
2. 适用场景不同
   qPCR：成本低、仪器普及、适合高通量、高载量样本
   ddPCR：无需标曲、抗抑制、低生物量样本更强
3. 关键数据
   健康人粪便：10¹¹–10¹³ 16S 拷贝/克干重
   化疗 / 移植 / 抗生素后：可低至 10⁶ 拷贝/克干重
   最大变异来源：DNA 提取，而非 PCR 或稀释
4. 可拓展计算
   结合宏基因组 / 16S 测序相对丰度，还能算出：每克粪便总原核细胞数、每个物种绝对丰度。

研究结论
该方法可用于研究人类健康与疾病（如克罗恩病、抗生素治疗过程）中的原核生物载量变化，也可评估样本采集和储存条件（如防腐剂类型）对定量的影响。

局限性：PCR方法无法区分细胞的死活状态；此外，由于不同原核生物基因组中16S拷贝数不一（1到10个以上），测得的基因拷贝数并不完全等于细胞总数。
总结而言，这篇文章为微生物组实验室提供了一套高通量、低成本且可重复性强的绝对定量方案，能够在不进行额外测序的情况下，快速测定冷冻或防腐处理样本中的微生物浓度。

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