欢迎回到《Binding Assays - More Than One Way to Achieve your Goals》系列文章。

在本篇中，我们将重点介绍两种更高级的结合实验检测方法：

• TR-FRET（时间分辨荧光共振能量转移）
• BRET（生物发光共振能量转移）

看看这些技术如何进一步提升Binding Assay的灵敏度、降低背景干扰，并满足高通量筛选（HTS）等更复杂的研究需求。

Time-resolved FRET（TR-FRET）

TR-FRET Binding Assay 可以理解为一种改良版的 FRET Binding Assay，其中传统 FRET 中的受体荧光基团被镧系元素（lanthanide）所替代。该技术常用于研究信号通路，以及 G 蛋白偶联受体（GPCR）激动剂/拮抗剂的筛选。

在相关演讲中，Prof. Charlton 介绍了如何利用 TR-FRET 研究并优化结合动力学（binding kinetics）。

镧系元素的使用，使实验既能够在检测前引入时间延迟，又能够通过 FRET 提高供体荧光检测的特异性。由于背景荧光显著降低，TR-FRET 相较于单独使用 FRET 或 TRF，能够在 Binding Assay 中提供更高的灵敏度。这种更高的灵敏度意味着，即使使用极少量的试剂，也能够获得良好的检测限（LOD）。在低至 2 µl 的体积下，实验仍然可以实现信号检测，同时仅需极少的分析物纯化步骤。

这使得 TR-FRET 能够适用于 384、1536 以及 3456 孔微孔板，因此成为高通量筛选（HTS）Binding Assay 的优选方法。目前主要存在四种 TR-FRET 化学体系，结合适当的抗体（以及 biotin 等其他亲和标签）后，可用于大量不同类型的结合相互作用检测：

• Homogeneous Time Resolved Fluorescence（HTRF®）
• LanthaScreen™
• Lance®
• THUNDER

Table 1：TR-FRET 技术中的供体与受体特性

 
除了商业化试剂盒之外，TR-FRET 的供体与受体对也可以自由组合，前提是供体发射光谱与受体激发光谱之间存在足够的重叠。这一点在应用案例《Differential binding of ∆9-tetrahydrocannabinol derivatives to type 1 cannabinoid receptors (CB1)》中已有展示。

所有 TR-FRET 实验都会产生两个发射信号：一个来自通过 FRET 激发后的荧光信号，另一个来自镧系元素本身的发射信号。因此，大多数 TR-FRET 实验并不会只计算 FRET 信号本身，而是计算 FRET Ratio（例如 665 nm / 620 nm）。FRET Ratio 的计算能够有效消除培养基带来的干扰，并使实验不受常规实验条件（如培养基、血清、biotin 以及有色化合物）的影响。

在科学演讲《Targeting the type 1 cholecystokinin receptor to screen for novel obesity treatments》中，研究人员建立了一种 TR-FRET Binding Assay，用于筛除 orthosteric 或 negative-allosteric 结合分子。此外，也存在能够同时读取两个信号（multiplexing）的 TR-FRET 竞争性结合实验。这类实验通常采用 terbium 标记供体，并以绿色和红色染料作为受体。¹

在案例《Pioneering Pre-Clinical Drug Discovery with Advanced Assays》中，来自 Excellerate Bioscience 与 University of Nottingham 的 Nick Holliday 讨论了 PHERAstar® FSX 在基于 TR-FRET 的动力学结合分析中的优势。

BRET Binding Assays

生物发光（Bioluminescence）已经在生物研究中广泛应用约 40 年。发光实验利用 luciferase 酶产生光信号。最早在细菌中被克隆的 luciferase 之一，是来源于北美萤火虫（North American firefly）的 firefly luciferase。² 多年来，研究人员已经发现了多种不同类型的 luciferase。

Luciferase 会与其天然底物（例如北美萤火虫中的 luciferin）发生反应，并在 ATP 与氧气存在下生成氧化产物（oxyluciferin）。该产物形成时处于激发态，当电子回到较低能级时，便会释放光信号。

在过去 20 年中，luciferase 越来越广泛地被应用于 BRET Binding Assay。BRET 与 FRET 和 TR-FRET 非常相似，不同之处在于：BRET 中用于其中一个结合对象的供体（donor）是 luciferase。

将 luciferase 作为供体的优势在于，研究人员可以直接构建带有 luciferase 标签的目标蛋白（例如 GPCR），并较容易地将其用于基于细胞的 Binding Assay，相较于 FRET 和 TR-FRET 更加方便。

BRET 的另一个重要优势是：实验不需要外部激发光。实验仅需加入 luciferase 底物即可。这避免了在使用光源激发荧光团或镧系元素时可能出现的问题，例如：

• 荧光漂白（photobleaching）
• 细胞组分产生非特异性背景荧光

 BRET 实验发表于 1999 年³ ，此后，研究人员尝试了多种 luciferase 作为供体，以及多种荧光分子作为受体。

其中最重要的进展之一，是 NanoLuc luciferase 的开发。这是一种小分子量酶，其发光强度约为 Firefly Luciferase 的 150 倍。Promega 基于 NanoLuc 开发出了 NanoBRET™ 平台，用于研究活细胞中的蛋白-蛋白相互作用。

BRET 的一个重要应用，是实时研究激动剂与细胞膜受体之间的结合过程。这一点也在网络研讨会《Real-time profiling of receptor pharmacology》中进行了进一步讨论。

另一个应用案例见于《Identification of peptide ligands for orphan GPCRs by measuring Ca2+ -induced luminescence in transfected cells》，该研究利用磁力搅拌器、加热器以及活细胞注射系统完成实验。

近年来，CRISPR 技术也被用于编辑活细胞 DNA，将 NanoLuc 标记到目标 GPCR 上。形成的融合蛋白可直接作为 BRET donor，从而避免了外源性 donor 表达需求（相关案例可见应用说明）。这一策略极大拓展了 BRET 在活细胞蛋白-蛋白相互作用研究中的应用价值。⁴

此外，这类基于 BRET 的实验体系还可用于研究 G-protein dissociation。过去，相较于 TR-FRET 和 AlphaScreen，BRET 一直存在灵敏度较低、动态范围较小的问题。这主要是由于所使用的 luciferase 信号强度有限。然而，NanoLuc 的出现已经显著改善了这一问题，因此 BRET 在 Binding Assay 与高通量筛选中的应用正在持续增长。

另一种利用发光研究相互作用的方法是 HiBiT CETSA。该实验利用与目标蛋白（POI）融合的片段化 HiBiT NanoLuc luciferase。在生理条件下，片段 luciferase 可以重新组装形成具有功能的完整酶；而当蛋白受热变性后，则无法完成组装。

HiBiT CETSA 通过加入潜在配体研究蛋白结合。当配体与目标蛋白结合后，其热稳定性会增加，并产生可测量的变化。

此外，片段化 NanoLuc luciferase 还可直接用于蛋白结合检测。例如在应用案例《Identification of androgen-disruptors using a cell-based androgen receptor dimerization assay》中，就采用了基于 NanoBiT® 的实验体系。

在本系列最后一篇文章中，我们还将介绍基于 AlphaScreen® 的应用方案，并最终总结如何根据实际应用需求，选择最适合的检测模式。期待与您下周再见！

References

1. Jacquemart, L., E.J. Dell, E.J., GPCR activation is measured using Cisbio’s cAMP and IP1 HTRF® HTplexTM cell-based assay, BMG LABTECH App note 209, 2010.
2. de Wet, J.R. et.al., Cloning of firefly luciferase cDNA and the expression of active luciferase in Escherichia coli, PNAS, 1985 82 (23) 7870-7873.
3. Xu Y, Piston DW, Johnson CH. A bioluminescence resonance energy transfer (BRET) system: application to interacting circadian clock proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 1999 Jan 5;96(1):151-6.White, C.W., (2017) Sci Rep. 7:3187.

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