经过前三篇文章，我们已经系统介绍了吸光法、荧光、荧光偏振（FP）、时间分辨荧光（TRF）、FRET、TR-FRET 以及 BRET 等多种 Binding Assay 检测技术。

本篇作为系列收官，我们将继续介绍另一项重要的均相检测技术——AlphaScreen®，并结合前文内容，对各种检测模式的特点进行总结，帮助研究人员根据实验需求、仪器配置以及应用场景，选择更适合自己的 Binding Assay 检测方案。

AlphaScreen®：一种高灵敏度的均相结合实验检测技术

AlphaScreen®（Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay，扩增发光邻近均相分析）光激发平台用于 Binding Assay 已商业化应用约20年。该技术的核心由两种不同类型的聚合物微珠组成：供体珠（Donor Bead）和受体珠（Acceptor Bead）。供体珠内含光敏剂，在680 nm光照激发下，会在周围水相介质中产生单线态氧（Singlet Oxygen）；受体珠则含有化学发光化合物。单线态氧的寿命约为4 µs，在此期间可在溶液中扩散约200 nm。当供体珠与受体珠彼此接近时，单线态氧即可到达受体珠，激发其产生520–620 nm波长范围内的发光信号。

通过将针对目标分子的特异性抗体直接偶联到微珠表面，AlphaScreen 可用于标记不同类型的目标蛋白。与荧光检测不同，荧光始终是以发射波长长于激发波长的形式产生，而 AlphaScreen 的检测机制则恰恰相反。因此，由680 nm激发光所产生的背景荧光不会被该技术检测到，这也是 AlphaScreen 具有较高灵敏度的重要原因。

典型的 AlphaScreen 配体结合实验之一，是开发竞争性结合实验，用于研究 ENL-Yeats 结构域与 Histone H3 的相互作用。ENL-Yeats 蛋白复合物通过 Yeats 结构域与 Histone H3 结合，当 Histone H3 上多个赖氨酸残基发生乙酰化（acetylation）或巴豆酰化（crotonylation）修饰时，这种结合会进一步增强。研究表明，Histone H3 与 ENL-Yeats 的相互作用，是多种急性白血病发生的重要驱动因素。

AlphaScreen 技术也存在一定局限性。首先，AlphaScreen 微珠对光较为敏感，因此实验需要在弱光条件下进行配制。其次，其检测信号会随着时间逐渐衰减，因此微孔板在完成实验配置后需要尽快进行读取。如果将实验板放置于冰箱中过夜保存，信号将无法维持；相比之下，基于 TR-FRET 的反应体系在微孔板中配制后能够保持更长时间的稳定性。此外，尽管 AlphaScreen 可以有效消除背景荧光，但样品中的抗氧化剂以及能够与单线态氧发生反应的金属离子仍可能显著影响检测信号。为克服这些不足，随后开发出了 AlphaLISA® 结合实验，其受体珠中掺入了铕（Europium），从而进一步提高了实验的灵敏度和可靠性。

如何选择适合自己的 Binding Assay 检测技术？

正如本系列所介绍的，Binding Assay 有多种不同的实现方式。选择哪一种检测技术，部分取决于实验室所配备的微孔板读数仪，也取决于不同试剂盒的成本，或针对特定实验对结合对象进行标记所需的成本。

目前，微孔板读数仪拥有从基础型号到高端型号的多种配置。高端仪器能够以较高灵敏度完成本文介绍的所有检测模式，而除专用吸光检测仪之外，大多数微孔板读数仪至少都具备荧光、发光和吸光检测功能。

在这种情况下，相较于吸光法，通常更推荐采用基于荧光的 Binding Assay，因为它能够在更宽的检测范围内提供更强、更具特异性的检测信号。以 ELISA 为例，基于荧光的检测方案通常需要更少的洗涤步骤。事实上，目前市场上几乎所有吸光法试剂盒，包括酶活性检测、蛋白浓度测定、细胞活力检测等，都已有相应的荧光检测版本。虽然荧光法试剂盒成本略高，但实验操作更加简单，同时检测灵敏度也更高。

对于兼容更多检测模式的高端微孔板读数仪，则可进一步支持 FRET、TR-FRET 或 AlphaLISA 等结合实验。这些检测技术兼具实验建立简单和高灵敏度等优势，为研究人员提供了更多实验选择。

另一个需要考虑的重要因素是，没有任何一种检测技术能够适用于所有实验。每种检测方式产生的光信号，都可能受到化合物库中的个别化合物、细胞样本或体液成分的不可预测影响。

在化合物库的高通量筛选（HTS）过程中，通常会同时建立多种检测方法，因为不同检测技术筛选得到的活性化合物并不会完全重合。例如，在一项针对 SIRPα-CD47 相互作用抑制剂的研究中，研究人员建立了两种 TR-FRET 实验（Lance 和 HTRF）以及一种 AlphaScreen 实验，对90,000个化合物进行了筛选。在预筛选阶段，三种检测技术获得了不同的活性命中率（Lance 为0.2%，HTRF 和 AlphaScreen 均为1.1%），且结果存在部分重叠。研究人员发现，Lance 检测体系产生的假阳性少于 HTRF，因此最终采用 Lance 作为初筛方法，并利用 AlphaScreen 作为正交验证实验（orthogonal confirmation assay）。因此，在建立 Binding Assay 时，对多种检测方法进行评估，并选择最适合目标研究对象的检测方案至关重要。

最后，对于文献中报道的大多数 Binding Assay，都可以根据所采用的光学检测技术进行分类；同样，绝大多数光学检测技术也都能够用于开发 Binding Assay。因此，选择一台合适的微孔板读数仪同样十分关键。

CLARIOstar® Plus 和 PHERAstar® FSX 是 BMG LABTECH 推荐用于 Binding Assay 的两款微孔板读数仪，兼容目前主流的所有检测技术。其中，CLARIOstar® Plus 凭借 Linear Variable Filter（LVF）单色器 和 EDR（Enhanced Dynamic Range） 技术，为 Binding Assay 提供了极高的实验灵活性；而 PHERAstar® FSX 则结合 SDE（Simultaneous Dual Emission） 技术和激光光源，实现了更高的检测灵敏度和更快的检测速度。

此外，AAS（Atmospheric Control System）系统能够在实验过程中提供稳定且不受外部环境变化影响的温度控制，从而提高对温度敏感反应（如 Binding Assay）的实验稳定性。

从吸光法（Absorbance）到荧光（Fluorescence），从 FRET、TR-FRET 到 BRET，再到本篇介绍的 AlphaScreen®，我们已经完成了《Binding Assays - More Than One Way to Achieve your Goals》四篇系列内容的分享。

在实际科研工作中，并不存在一种能够适用于所有 Binding Assay 的“最佳”检测技术。不同的检测模式在灵敏度、检测原理、实验成本、操作流程以及适用场景等方面各具优势。只有充分理解各种技术的特点，并结合实验目标、样本类型、检测需求及仪器平台综合评估，才能建立更加稳定、高效且可靠的结合实验。

希望本系列能够帮助您系统了解目前主流的 Binding Assay 检测技术，为今后的实验设计和方法选择提供参考。

感谢您一路关注本系列，我们下一个技术专题再见！

 

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