欢迎回到《Binding Assays - More Than One Way to Achieve your Goals》系列。

在上一篇中，我们介绍了Binding Assay的基础概念、竞争结合实验以及吸光检测方法。本篇将进一步聚焦几种更高灵敏度的检测技术，包括：

• 荧光检测（Fluorescence）
• 荧光偏振（Fluorescence Polarization）
• 时间分辨荧光（TRF）
• FRET检测

这些技术正在越来越多地应用于药物研发、生物标志物分析以及复杂分子相互作用研究中。

基于荧光的Binding Assay

自然界中，能够在可见光波段产生荧光的化合物其实并不多。因此，在Binding Assay中，如果对配体或靶标生物分子进行荧光标记，通常能够显著提升实验灵敏度，相较于传统吸光法（Absorbance）具有明显优势。

一般来说，荧光检测能够实现：

• 更低的检测限（LOD）
• 更宽的线性检测范围
• 更高的信号灵敏度

此外，对于小分子、多肽以及蛋白而言，荧光标记通常也较容易实现，且已有大量成熟、低成本的标记试剂可供使用。

不过，荧光检测并非没有挑战。其中一个典型问题是：

荧光淬灭（Fluorescence Quenching）

当荧光标记的配体与细胞受体或大型生物分子结合后，可能会发生荧光信号减弱的现象。

造成荧光淬灭的原因包括：

• 荧光标记分子构象变化
• 分子聚集状态变化
• 结合位点附近存在色氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸或组氨酸残基

这些因素都会影响荧光强度与实际配体浓度之间的对应关系。最终导致：

• 实验灵敏度下降
• 定量准确性降低

荧光偏振结合分析

虽然基于荧光的结合分析通常比吸光度检测更灵敏，但依然可能受到背景噪声的影响。特别是在细胞裂解液中检测生物标志物时，样品中的大量杂质往往会带来干扰，因此通常仍需要进行纯化步骤。

为降低这种非特异性背景信号，研究人员开发了多种光学检测技术。这类方法并非直接检测荧光团本身，而是通过调控检测方式来消除背景噪声，荧光偏振（Fluorescence Polarization，FP）便是其中之一。

荧光偏振的原理基于平面偏振光对荧光分子的激发。当荧光团被光激发后，在发射更长波长光之前，会存在一个短暂延迟，即“荧光寿命（fluorescence lifetime）”。

对于分子量较小（<20,000 Da）且标记了荧光素（fluorescein）的小分子而言，在荧光寿命期间，它们能够在缓冲液中快速旋转多次。因此，当大量这类分子同时被偏振光激发时，由于它们在发光时的取向彼此随机，最终发射出的光将呈现非偏振状态。

这一特性可以应用于结合分析。当小分子标记物以非共价方式结合到更大的蛋白质上，并且复合物总分子量超过30,000 Da时，在荧光寿命期间，该复合物几乎不会发生明显旋转（因为大分子在溶液中受到更大的阻力）。因此，如果用偏振光激发该复合物，其发射光依然会保持偏振状态（图1）。

这一特性已被广泛应用于结合分析。其优势在于：

• 仅需对其中一个结合组分进行标记
• 实验建立相对简单
• 成本较低
• 由于只检测偏振光，因此能够有效降低非特异性背景噪声

不过，该方法也存在一定限制，即被标记的结合组分分子量需要低于30,000 Da（以荧光素为例），且越小越理想。否则，无论其是否与另一蛋白结合，都会发射偏振光，从而影响实验判断。

在应用方面，一篇关于利用荧光偏振竞争实验测定降钙素和 AMYR 激动剂 AM833 驻留时间（Residence Time）的应用说明展示了：荧光偏振可用于测定配体-受体相互作用的结合与解离速率。

另一篇题为《利用荧光偏振评估青霉素与 PBP5 相互作用以研究抗生素耐药性的分子基础》的应用说明中，则利用荧光标记的青霉素衍生物，监测青霉素与不同变体青霉素结合蛋白5（PBP5）的相互作用。PBP5负责细菌细胞壁的交联形成。

此外，《利用荧光偏振测量重构生物钟系统》的应用说明则展示了另一类基于荧光偏振的检测案例：通过连续5天监测调控昼夜节律的 KaiA、KaiB 与 KaiC 蛋白之间的相互作用，研究生物钟节律变化。

时间分辨荧光（TRF）结合分析

另一种能够显著降低背景噪声的技术是时间分辨荧光（Time-Resolved Fluorescence，TRF）。其核心思路是利用不同荧光物质之间荧光寿命的差异，分离目标荧光信号。

大多数荧光团的荧光寿命都短于10 ns，而镧系元素如铕（europium）、铽（terbium）、镝（dysprosium）和钐（samarium）的荧光寿命则非常长，可达1 µs至1 ms。

在典型TRF结合分析中，通常会使用镧系元素对其中一个结合组分进行标记，并在其最大激发波长（347 nm）下进行激发。随后，在检测信号之前引入一段时间延迟（通常约400 µs）。

这段延迟时间可以使样品中杂质产生的短寿命背景荧光先行衰减，仅保留镧系元素的长寿命荧光信号用于检测。因此，相较于普通荧光结合分析，TRF具有更高的灵敏度，同时也减少了对样品纯化步骤的依赖。

TRF已被广泛应用于ELISA实验。例如，由 PerkinElmer（现为 Revvity）开发的 DELFIA TRF 检测系统，便采用铕标记进行检测。目前，市场上也已有大量针对不同生物标志物的配对抗体可供选择。

基于 FRET 的结合分析

FRET（荧光共振能量转移）是指激发能量在两个荧光团之间以非辐射方式进行转移。通常，直接被光激发的荧光团称为“供体（donor）”，而通过FRET被激发的荧光团称为“受体（acceptor）”。

只有当两个荧光团之间距离小于10 nm时，FRET才会发生。此外，供体的发射光谱还必须与受体的激发光谱存在重叠。

FRET已被广泛应用于结合分析（图2）。在实验中，两个结合组分（例如蛋白质或DNA）分别被不同荧光团标记。当二者形成非共价相互作用后，激发供体荧光团即可通过FRET使受体荧光团同时发光。

从某种意义上来说，FRET类似于一种“荧光级联”或“多米诺效应”：一个荧光团激发另一个荧光团，后者在未被直接激发的情况下释放荧光。

受体荧光团发出的FRET信号对所研究的结合相互作用具有高度特异性。因此，FRET分析通常比普通荧光分析更加灵敏，也大幅减少了实验中的纯化需求。许多实验甚至可以直接在细胞裂解液中完成。

不过，相比荧光偏振法，FRET的主要缺点在于需要对两个结合组分都进行标记，这会增加实验建立的复杂度与成本。

但与此同时，FRET结合分析并不受荧光偏振法中分子量限制的影响。

应用说明《利用基于FRET的蛋白复合物测量结合Job Plot确定化学计量比》展示了：如何通过基于FRET的方法，在微孔板读板机上成功实现蛋白-蛋白相互作用化学计量比的分析。

在本系列文章的下一章节中，我们将进一步介绍更先进的检测模式，例如 TR-FRET 与 BRET。期待与您再次见面。
 

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