光学显微成像是生物医学研究的核心工具，广泛应用于基础生物机制解析与临床病理检测场景，但视场光照不均引发的渐晕、拼接马赛克效应会严重降低图像质量，干扰定量信息提取与后续分析。现有平场校正算法虽覆盖空域、频域等多种技术路径，但参数调优高度依赖人工试错，且行业内缺乏标准化的图像质量客观评估体系，校正效果难以稳定保障。该研究提出名为EVEN的机器学习驱动工作流，可定量评估原始与校正后图像的光照不均程度，自动筛选最优校正方案，实现多模态光学显微图像的平场校正自动化优化，可无缝集成到常规显微成像处理流程中。

该研究由Elena Corbetta、Matteo Calvarese、Patrick Then、Hyeonsoo Bae等学者共同完成，论文题为《Automatic optimization of flat-field corrections by evaluation and enhancement (EVEN) in multimodal optical microscopy》，于2026年在线发表于《Nature Communications》。

重要发现
01光照不均伪影的量化表征体系构建
光照不均是光学显微成像的普遍伪影，本质为视场内照明强度分布不均，典型表现为单视场下强度从光轴向边缘逐步衰减的渐晕效应，以及大样本拼接成像中相邻子图强度不一致引发的马赛克效应。这类伪影在非线性成像、多通道多模态成像场景中影响尤为显著：非线性信号产生过程会将光照的非均匀性非线性传递至输出信号，而不同成像通道的物理机制、光学色差与靶标组织组分差异，会导致各通道光照不均模式存在明显差异，最终造成多模态图像承载的形态化学信息失真与损耗。

存在光照不均时大样本光学成像实验流程

针对两类核心伪影，研究定义了两项可量化的图像质量度量，用于客观标记光照不均的严重程度。其一为边缘能量比，通过计算视场边缘区域像素能量占整幅图像总能量的比例，表征单视场渐晕的强弱，比值越低代表边缘强度衰减越显著；该指标可通过叠加所有拼接子图的强度总和进行计算，天然适配大视场拼接图像的评估。其二为功率谱正突出度，利用拼接马赛克效应在空间频域产生周期性峰值的特性，计算功率谱中周期性峰值相对于基线的突出程度总和，峰值突出度越高代表马赛克伪影越强。

研究通过半合成模拟图像与已知实验数据集验证了两项度量的有效性。在模拟数据中，随着光照不均程度逐级提升，边缘能量比呈稳定下降趋势，正突出度呈持续上升趋势；在包含40组强伪影图像与40组高质量校正图像的实验数据集中，两类图像的度量值存在显著统计学差异，证实两项指标可有效区分光照不均的严重程度，为后续自动化评估提供了可靠的特征基础。

消除光照不均的EVEN算法：从实验伪影初步评估到实验图像自动优化增强

模型训练采用80组实验单通道非线性成像数据，包含40组存在强光照不均的劣质图像与40组校正效果良好的优质图像。五折交叉验证结果显示，模型平均准确率可达0.81，对优质图像的灵敏度为0.95，对劣质图像的特异度为0.67。研究进一步在包含23组人头颈组织多模态成像的独立测试集上验证模型性能，测试样本涵盖相干反斯托克斯拉曼散射、二次谐波产生、双光子激发荧光三个成像通道，分别采用三种经典校正算法处理后输入模型预测。以专家视觉评估为参照，模型的平衡准确率达0.74，灵敏度0.84，特异度0.62，与人工视觉判断具有良好的一致性。

研究进一步将模型输出的决策分数解释为连续的图像质量分数：正分数对应优质图像，负分数对应存在显著光照不均的劣质图像，同一样本不同校正方案的相对分数可直接生成质量排序。对测试集的排序分析显示，原始图像普遍对应较低的负向分数；不同校正算法在不同通道上表现存在明显差异，不存在单一算法可适配所有成像通道的情况，从数据层面验证了单通道独立优化的必要性。

基于定量指标对光照不均开展人工评估

研究在多类生物成像场景中验证了该工作流的有效性。在人头颈组织多模态非线性成像中，EVEN可针对不同信号通道匹配最优校正算法，例如对相干反斯托克斯拉曼散射通道选择频域校正方法，对双光子激发荧光与二次谐波产生通道选择空域回顾式校正方法，最终融合图像的视场强度均匀性显著优于单一算法校正结果，拼接边缘的强度跳变得到最大程度抑制。

人体头颈组织多模态非线性成像数据的评估与优化增强

在染色细胞多通道荧光成像场景中，EVEN同样可实现单通道的最优校正筛选，且校正质量的提升可直接惠及下游图像分析任务：采用通用细胞分割算法对校正后图像进行处理时，经EVEN优化的图像可识别出更多细胞，尤其是在拼接子图的边缘区域，细胞轮廓的识别准确性显著提升。此外，研究还验证了EVEN方法的泛化能力：其可适配小鼠脑切片单通道成像的质量排序，可用于时序成像数据的校正参数调优，针对非径向的侧向阴影伪影，仅需调整边缘能量比的计算区域即可适配，无需重新训练模型。

染色细胞实验成像的评估与优化增强

创新与亮点
该研究突破了光学显微成像领域长期存在的平场校正评估难题。传统校正流程依赖人工视觉判断与反复参数试错，效率低下且结果主观性强，多模态多通道成像中各通道校正效果不一致的问题更缺乏自动化解决方案。EVEN方法首次建立了可量化、可自动化的光照不均评估体系，通过两项物理意义明确的图像度量结合线性判别模型，实现了校正效果的客观排序与最优方案自动筛选。

总结与展望
EVEN方法为光学显微成像的光照不均校正提供了自动化、定量化的评估与优化框架，有效弥补了现有校正流程缺乏客观质量标准的短板，在多模态生物医学成像场景中展现出良好的适用性与泛化能力。未来可通过引入更多图像质量度量拓展评估维度，探索基于原始图像特征直接预判最优校正算法的方案，进一步提升处理效率，并将方法拓展至更多类型成像伪影的自动校正。

DOI:10.1038/s41467-025-68150-0.