谱系示踪实验设计全攻略：从Cre-loxP原理到转基因小鼠选配方案
2026-07-10 来源:南模生物 点击次数:18谱系示踪是研究细胞命运的核心技术，但涉及重组酶小鼠、报告基因工具鼠的选型搭配往往让人一头雾水。本文从实验设计思路出发，系统梳理Cre-loxP系统在谱系示踪中的应用逻辑——从单Marker基础模式到多Marker升级模式，从单色报告到交叉/独家/嵌套报告基因系统，再到双重组酶联用的实战案例（EMTracer系统追踪肿瘤EMT），帮你理清遗传修饰动物模型的组合策略，一篇搞定课题设计中的选鼠难题。
Step 1｜了解谱系示踪是什么？
谱系示踪，通常是指使用各种手段对某类祖细胞亚群进行标记，在后续时间点对其分化命运进行检测。通俗来说，就是给细胞加一个"身份证"，这个标记能伴随它的增殖分化一直延续下去，在我们的观察期内始终可追踪。
要满足这个目的，就必须使用以Cre-loxP为代表的重组酶标记方式——只有基于基因组水平的永久性标记，才能保证标记不会在细胞分裂中丢失。
想了解不同标记方式的区别与应用？可参考：【谱系示踪系列第一期】基础细胞标记方式
Step 2｜使用重组酶标记需要哪些转基因小鼠？
Cre-loxP系统分为两个部分：Cre重组酶与loxP位点。Cre重组酶识别相同的loxP（以及lox变体）位点并催化重组，介导目标基因发生改变。类似的重组酶系统还有：Dre重组酶与Rox位点、FLP重组酶与FRT位点。
那么在谱系示踪中，如何借助这个系统合理设计小鼠进行研究呢？谱系示踪实验需要两大类小鼠配合使用：
· 重组酶小鼠
携带由目标基因启动子驱动的Cre（或Dre、FLP）重组酶，决定"在哪类细胞中启动标记"。
· 报告基因工具鼠
携带被loxP位点flanking的Stop序列 + 下游荧光蛋白，决定"标记后细胞发什么颜色的光"。
这两类小鼠交配后，得到的双阳性后代才能实现标记特定细胞以及追踪其后代的目的。
图1. 重组酶小鼠与报告基因小鼠交配产生双阳性后代的原理
想标记固定类型的细胞，最关键的一步就是确定这类细胞如何被准确定位——这需要大量查阅文献来确定合适的Marker。
根据所需Marker数量的不同，课题设计分为两种模式：
基础模式：单Marker定位
如果目标细胞群拥有特异性的Marker，仅需1个Marker即可定位细胞。
重组酶小鼠的选择：
标记目标细胞群仅需单个细胞Marker（称为A），因此只需选择一种连接了A Marker的重组酶小鼠（简称为A-Cre）。至此，重组酶鼠的选择已经完成。
图2. 基础模式：单Marker定位
根据细胞标记所需的荧光报告基因数量，报告基因小鼠的选择包含：
· 单色报告基因小鼠 适用于单阳性细胞标记，一种颜色标记一类细胞。
· 多色报告基因小鼠（脑虹系统） 适用于探究同一组织中单个细胞的分化命运，可在同一群细胞中用不同颜色区分个体克隆。
想了解更详细的脑虹系统知识，可参考：【谱系示踪系列第二期】单重组酶介导的多色报告系统方法
升级模式：多Marker精准定位
有时候，课题需要更精确的研究设计，目标细胞必须用两种（甚至以上）类型的Marker才能确定。此时就需要"基础款"与"高端款"遗传修饰动物模型相结合。
以2个Marker为例（Marker A与Marker B），目标细胞群可能是A+B+、A-B+、A+B-等多种情况。这种场景下，组合搭配策略就需要有考究了。
策略一："高端款"报告基因小鼠 + "基础款"重组酶小鼠
图3. 多Marker精准定位，交叉报告系统+独家报告系统+嵌套报告系统
选择A-Cre、B-Dre（或A-CreER、B-DreER）的基础款重组酶小鼠后，为满足精准标记目的，可以搭配以下三种"高端款"报告基因工具鼠：
· 交叉报告基因系统 标记Marker A+B+双阳性细胞，适用于双阳性细胞类型标记。
· 独家报告基因系统 标记Marker A+B-细胞，有先后顺序，适用于A-CreER与B-Dre单个诱导性重组酶标记。
· 嵌套报告基因系统 标记Marker A+B-细胞，无先后顺序，适用于A-CreER与B-DreER多个诱导性重组酶标记。
策略二："高端款"重组酶小鼠 + "基础款"报告基因小鼠
图4. "高端款"重组酶小鼠 + "基础款"报告基因小鼠
选择LoxP-Stop-LoxP-reporter的基础款报告基因小鼠时，重组酶小鼠也可以被设计为"高端款"：
· roxCre 将rox-Stop-rox（RSR）插入Cre编码区，适用于双阳性细胞类型标记。（loxDre同理）
· CrexER 将rox位点插入到CreER的ER区两侧，适用于双阳性细胞类型标记。（DrexER同理）
· dCreER 将rox位点插入到CreER整体编码区的两侧，适用于已知阳性&阴性Marker细胞标记。（dDreER同理）
策略三：双"高端款"联手组合
"高端款"重组酶小鼠也能搭配"高端款"报告基因小鼠。
以嵌套报告小鼠与loxDre小鼠联用为例：使用A-CreER小鼠、B-loxDre小鼠、NR1小鼠进行交配。理论上，该小鼠无tamoxifen诱导时，无细胞被标记；在tamoxifen诱导后，A+细胞会被标记为绿色，而在诱导以后，A+细胞中表达B的细胞才会被标记为红色。
图5. 通过两种高端款的连用，在AB表达时间层面精确地标记了目的细胞。
转移的肿瘤细胞是否发生上皮细胞向间充质细胞的转换（epithelial-mesenchymal transition, EMT）一直是肿瘤研究领域的一大热点。前期研究利用体外细胞培养以及移植方法认为EMT过程对肿瘤细胞转移具有重要作用，但缺乏直接的体内实验证据。
肿瘤模型中瞬时的、可逆的EMT过程很难用单重组酶系统精准捕捉到。因此，周斌研究组选择使用roxCre的相似改造思路，构建了loxDre重组酶，并利用双重组酶报告基因小鼠中的嵌套报告基因小鼠，尝试捕捉瞬间的EMT画面。
实验设计：
科研人员在自发性乳腺癌肿瘤模型小鼠MMTV-PyMT的背景上，利用Kit-CreER来标记小鼠乳腺管腔上皮细胞；利用间充质细胞的分子标记（例如Vimentin和N-cadherin）作为发生EMT的Marker，构建了基因敲入小鼠EMTgene-LSL-Dre（N-Cad-LSL-Dre和Vim-LSL-Dre）。将以上几种重组酶小鼠与双重组酶报告基因小鼠NR1交配获得EMTracer系统，来同时示踪发生过和未发生过EMT的乳腺肿瘤细胞。
图. EMTracer系统的基因重组图解 [1]
重组逻辑如下：
1. Kit-CreER与报告基因NR1的LoxP发生重组，使Kit+的乳腺管腔上皮细胞被标记上绿色荧光蛋白（ZsGreen）。
2. Kit-CreER与EMTgene-LSL-Dre的LoxP发生重组，使介于两个LoxP之间的Stop序列被切掉，当发生上皮细胞向间充质细胞的转换后，EMTgene就会启动表达。
3. EMTgene后面的Dre表达出来，与报告基因NR1的Rox发生同源重组，使报告基因NR1位于两个Rox位点之间的Rox-LoxP-Stop-LoxP-ZsGreen-PolyA-Rox序列被切掉，使发生过EMT的细胞由之前的绿色荧光蛋白（ZsGreen）转变成红色荧光蛋白（tdTomato），实现对EMT的监测。
利用两种基因（Vimentin和N-cadherin）构建两套EMTracer系统进行对比，可以发现发生转移的细胞群中，采用Vim-EMTracer系统标记的细胞呈现绿色，而采用N-cad-EMTracer系统标记的细胞呈现红色，说明该乳腺癌转移发生EMT是N-Cadherin依赖性的。
图. 基因Vimentin和N-cadherin构建两套EMTracer系统的结果图解 [1]
Key Step｜查询南模生物Find Cre®数据库
成功完成以上步骤，恭喜你已经成为谱系示踪标记大师了！接下来就是根据课题研究的实际情况，购买或定制合适的小鼠进行繁育。这时候，如果有现成的Cre鼠工具库可以直接查询就帮大忙了。
南模生物深耕遗传修饰动物模型行业二十余年，为帮助科研人员快速精准地选择合适的Cre工具鼠，特推出Find Cre®数据库。该数据库包含600多种自主产权Cre/Dre重组酶工具鼠，以小鼠组织、器官和系统为主线，覆盖肺、肝、胃肠道、乳腺、胰腺、感觉器官、心血管系统、免疫系统、神经系统、泌尿生殖系统、骨骼肌系统以及其他组织器官。
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Reference
[1] Genetic Fate Mapping of Transient Cell Fate Reveals N-Cadherin Activity and Function in Tumor Metastasis. Li, Yan et al. Developmental Cell, Volume 54, Issue 5, 593-607.e5
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上海南方模式生物科技股份有限公司（Shanghai Model Organisms Center, Inc.，简称"南模生物"），成立于2000年9月，是一家上交所科创板上市高科技生物公司（股票代码：688265），始终以编辑基因、解码生命为己任，专注于模式生物领域，打造了以基因修饰动物模型研发为核心，涵盖多物种模型构建、饲养繁育、表型分析、药物临床前评价等多个技术平台，致力于为全球高校、科研院所、制药企业等客户提供全方位、一体化的基因修饰动物模型产品解决方案。
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