Sapphire FL激光扫描成像系统助力开发泛肿瘤近红外荧光探针CETIF6a
2026-09-14 来源:本站 点击次数:37近日，来自吉林大学等机构的研究团队，在《自然·通讯》上发表了一项突破性成果：他们开发出一款名为CETIF6a的新型近红外荧光染料。它不仅能在术中快速点亮多种肿瘤边界，更能像“分子渔网”一样，精准钓取并识别其结合的蛋白质，首次系统揭示了这类“肿瘤寻靶”染料的完整靶点图谱，为精准手术导航和靶向药物开发提供了全新思路。
1 破局：从“分子模板”到“最优候选”
研究者以已有良好肿瘤靶向能力的近红外染料IR-6B3为骨架，在其侧链上引入“点击化学”手柄，构建了一个探针库。经过实验筛选，一个带有6个碳原子侧链、名为CETIF6a的候选者脱颖而出。
实验数据显示，CETIF6a不仅保留了优异的光学性能（吸收峰近800 nm，发射峰约830 nm），其在肿瘤蛋白裂解液中的荧光强度比在癌旁组织中高出约10倍。在快速玻片染色实验中，CETIF6a仅需10分钟孵育，即可清晰区分肿瘤与癌旁组织，肿瘤边界勾画结果与金标准H&E染色高度一致。
更重要的是，CETIF6a的独特之处在于：它既能发光成像，又因其结构的“点击手柄”可以连接生物素，从而像磁铁一样，将与之结合的靶蛋白从肿瘤组织中“钓取”出来，进行系统鉴定——实现了“成像”与“靶点发现”的双重功能。
（A）通过将点击化学基团引入IR-6B3生成CETIF。R表示引入的点击化学官能团，包括叠氮基、炔基和DBCO，而n代表CETIF侧链中碳原子的数量。
（B）染料在PBS和临床样本蛋白裂解液中的荧光强度，染料和蛋白浓度均为10 μM（平均值±SEM，每组n=3个样本）。
（C）示意图说明利用肿瘤寻靶染料进行术中快速检测肿瘤切缘的玻片染色原理。
（D）CETIF介导的玻片染色在3个临床样本中区分肿瘤组织与癌旁组织（比例尺长度：5 mm）。H&E染色后确定的肿瘤和癌旁区域轮廓用轮廓线标示。
（E）图D中不同染料标记的肿瘤区域平均荧光强度统计数据（平均值±SEM，每组n=3个样本）。
（F）用于染料靶向蛋白质组鉴定的炔基标记和富集工作流程示意图。下方灰色虚线框中的图形元素注释了各种符号的代表含义。
（G）CETIF6a从临床癌组织裂解液中标记和富集蛋白的代表性分析（n=3次独立实验）。CBB：考马斯亮蓝染色。
（H）点击和富集后，通过SDS-PAGE凝胶电泳检测的共价结合复合物的荧光强度。
（I）点击前后共价结合复合物的荧光强度。最强荧光强度归一化为1.00。富集前后相似的荧光波动用红色圆圈标出，并用箭头指示对应关系。
该图展示了探针的设计思路和筛选结果。研究者以IR-6B3为骨架，在其侧链上引入不同的“点击化学”基团，并优化侧链长度。在临床宫颈癌样本的快速染色实验中，带有炔基的探针展现出了最佳的肿瘤特异性染色效果，荧光强度高且背景低。进一步优化侧链长度后，CETIF6a（6个碳原子侧链）在标记亮度和富集效率上取得了最佳平衡，被确定为最终的双功能探针。该图的核心结论是：CETIF6a是兼顾了成像性能和靶点富集能力的最优候选分子，能够成功从临床肿瘤样本中“钓取”并富集其靶蛋白。
2 揭秘：CETIF6a的靶点谱系与分子机制
研究者利用CETIF6a的“钓取”能力，对5例宫颈癌患者的肿瘤与癌旁组织进行了全蛋白质组分析。结果令人震撼：CETIF6a在肿瘤组织中结合的特异性蛋白数量，是癌旁组织的5-15倍。这些蛋白并非单一“超级靶点”，而是通过多靶点协同的方式实现肿瘤可视化，这恰恰解释了为何它能有效克服肿瘤异质性。
宫颈鳞状细胞癌中CETIF6a靶向蛋白质组的定量分析
（A）用于鉴定CSC中CETIF6a靶向蛋白质组的标记和富集工作流程示意图。
（B）按照图A中流程进行的蛋白质组标记（输入）和富集（纯化）（n=5次独立重复，结果一致）。比例尺：1 mm（1× H&E），100 µm（20× H&E）。
（C）5个CSC样本中，T组相对于P组上调的靶蛋白的韦恩图。
（D）靶蛋白强度与倍数变化的散点图。两个候选蛋白被突出显示。
（E）CETIF6a@KYNU和LCP1的荧光强度（n=3次独立重复，结果一致）。CBB：考马斯亮蓝染色。
（F）5个CSC样本中上调靶蛋白的分子量分布。
（G）3D组织学电泳原理示意图。
（H）F0124样本在3D组织学电泳中第2-12层的成像结果。紫色和橙色虚线勾勒的区域分别对应H&E染色和3D组织学电泳定义的肿瘤区域。
（I-J）第2-12层T/P比和相似度的合并统计分析。平均值最高的层用红色五角星标记（平均值±SEM，n=5个样本，所有样本均进行3次重复分析）。
（K）与鳞状细胞癌高度相关的靶蛋白的分子量与倍数变化散点图。两个候选蛋白（PCNA和DNAJC9）被突出显示。
（L）CETIF6a@PCNA和DNAJC9的Dye@蛋白复合物的荧光强度（n=3次独立重复，结果一致）。
（M）临床CSC样本中PCNA和DNAJC9蛋白的典型免疫组化模式。比例尺：50 µm，每组n=15个样本。
（N）15个样本的免疫组化强度统计结果（平均值±SEM，P = 6.10 × 10⁻¹¹ & 4.88 × 10⁻⁵，配对t检验，双尾）。
该图系统揭示了CETIF6a在宫颈癌中的靶向机制。通过对5例宫颈癌患者样本进行定量蛋白质组学分析，发现CETIF6a在肿瘤组织中结合了5-15倍于癌旁组织的特异性蛋白，这些蛋白通过多靶点协同作用实现肿瘤可视化，有效克服了肿瘤异质性。进一步采用“3D组织学电泳”技术将组织蛋白按分子量分层，发现25-35 kDa的蛋白层在区分肿瘤和癌旁组织时效果最佳。在该分子量范围内，锁定了两个关键靶点：PCNA（增殖细胞核抗原）和DNAJC9（分子伴侣），实验证实CETIF6a能与它们高效结合并发出强荧光。免疫组化染色进一步验证，这两个蛋白在15例宫颈癌患者的肿瘤组织中普遍高表达，而在癌旁组织中表达很低。该图的核心结论是：CETIF6a通过多靶点协同机制实现肿瘤特异性标记，PCNA和DNAJC9是关键的功能性靶点。
进一步分析表明，这些靶点蛋白共同富集在核糖体、蛋白酶体、碳代谢等与癌细胞恶性增殖、代谢重编程密切相关的核心通路上。这意味着，CETIF6a捕获的不是某个偶然的蛋白，而是肿瘤发生发展过程中的“核心团伙”。
CETIF6a与靶标的结合机制
（B）图A中数据的定量分析。
（C）胰蛋白酶消化前（A）和后（B），组织裂解液中CETIF6a@靶标复合物的荧光强度变化（n=3次独立重复，结果一致）。
（D）图C中数据的定量分析。
（E）蛋白质上的半胱氨酸残基与碘乙酰胺（IA）或CETIF6a反应的示意图，以及竞争性结合实验流程。
（F-I）图E中所示流程的竞争性结合实验的SDS-PAGE分析结果。泳道A：未处理蛋白；泳道B：先加CETIF6a，后加IA；泳道C：先加IA，后加CETIF6a。
（J）提出的CETIF6a与靶标结合的两步机制示意图。
该图深入揭示了CETIF6a与靶蛋白结合的分子机制。研究发现，如果破坏CETIF6a与靶蛋白结合后的“口袋”结构，荧光会显著下降，说明靶蛋白的疏水结合腔是维持其高亮度的关键。竞争性实验进一步证实，使用碘乙酰胺预先封闭靶蛋白的半胱氨酸残基，会完全阻断CETIF6a的结合和荧光产生，说明CETIF6a是通过其meso位氯原子与靶蛋白半胱氨酸的巯基发生亲核取代反应，形成稳定的共价键。该图的核心结论是：CETIF6a与靶蛋白的结合遵循两步机制——先进入疏水口袋增强荧光，再与半胱氨酸形成共价键实现稳定锁定。
3 拓展：泛癌种标记能力与共享靶点图谱
CETIF6a的潜力远不止于此。研究团队将其应用于乳腺癌、胆管癌、甲状腺癌、肝癌、胃癌、结直肠癌等多种癌症的临床样本。结果显示，在宫颈癌、乳腺癌、胆管癌和甲状腺癌中，CETIF6a的肿瘤边界勾画准确率均超过90%；而在肝癌、胃癌中仅部分样本可实现区分，结直肠癌样本诊断效果有限。
CETIF6a在多种肿瘤类型中的组织学检测解读能力
（A）不同肿瘤类型中通过3D组织学电泳进行肿瘤边界检测的分析示意图。
（B）各种肿瘤类型的T/P比统计。虚线表示阈值（T/P = 2）。
（C-E）乳腺癌、胆管癌和甲状腺癌的代表性3D组织学电泳图像，以及它们与H&E染色的相似度。
（F-H）乳腺癌、胆管癌和甲状腺癌各层T/P比的统计分析（平均值±SEM，n=3个样本，每个样本进行3次重复分析）。
（I-K）乳腺癌、胆管癌和甲状腺癌中，在T和P组中上调的靶蛋白丰度分布。
（L）4种癌症类型中共同肿瘤特异性靶蛋白的韦恩图。
（M）491个共享靶蛋白的KEGG通路富集分析。
（N）4种癌症类型中癌旁特异性靶蛋白的韦恩图。
（O）41个共享癌旁靶蛋白的KEGG通路富集分析。
该图证明了CETIF6a的“泛癌种”潜力。在乳腺癌、胆管癌和甲状腺癌中，CETIF6a的肿瘤边界勾画准确率均超过90%，与金标准H&E染色高度一致，且不同癌症的最佳成像层不同，体现了CETIF6a的多靶点适应能力。通过对宫颈癌、乳腺癌、胆管癌和甲状腺癌的靶点进行交叉分析，发现它们共享491个在肿瘤中显著上调的蛋白，这些蛋白主要富集在核糖体、蛋白酶体、碳代谢等与癌细胞恶性增殖和代谢重编程相关的核心通路中。相比之下，癌旁组织的共享蛋白则主要与补体、凝血等微环境相关。
通过对这四种有效癌种（宫颈癌、乳腺癌、胆管癌、甲状腺癌）的靶点进行交叉分析，研究者发现了一个惊人的事实：491个蛋白在四种癌症的肿瘤组织中均显著上调，并被CETIF6a捕获。这些共享靶点正是上述与癌细胞恶性增殖、代谢重编程相关的核心通路蛋白。也就是说，CETIF6a之所以能“一网打尽”多种癌症，是因为它靶向的是癌症共有的“致命弱点”。
CETIF6a靶标的结构和功能聚类
（B）按成员数量排序的前10个簇。
（C）第一大簇的KEGG通路相互作用网络分析。
（D）第一大簇的疾病本体（DO）富集分析。
（E）CETIF6a和ERK1蛋白的荧光分析（n=3次独立重复，结果一致）。
（F）通过LC-MS/MS鉴定的CETIF6a在ERK1蛋白上的结合位点（Cys178和Cys233）。
（G）两个结合位点的MS/MS谱图计数和结合能比较。
（H）非共价和共价对接下，Cys178和Cys233位点的结合能计算。
（I）分子动力学模拟中，CETIF6a结合至Cys178和Cys233位点的RMSD收敛曲线。
（J）CETIF6a与ERK1-Cys178结合前50 ns的亮度变化。
（K）从非共价对接状态到稳定共价状态的结合腔构象转变。
（L）CETIF6a-ERK1-Cys178结合腔内的静电势分布。
（M）CETIF6a与ERK1氨基酸残基关键相互作用图谱。
（N）ERK1上功能位点和修饰位点的空间定位。
该图对CETIF6a的靶点进行了系统性分类，并揭示了其与关键信号蛋白ERK1的相互作用细节。通过结构聚类分析，CETIF6a靶向的蛋白可被分为187个结构簇，其中最大的一个簇包含63个蛋白，与癌症信号转导、细胞迁移和侵袭密切相关，表明CETIF6a能有效捕获癌症核心功能蛋白。深入分析该簇中的代表性蛋白ERK1（一个关键的致癌激酶），证实CETIF6a能与之共价结合，并确定Cys178是主要结合位点。更重要的是，该结合位点紧邻ERK1的ATP结合位点和激活位点，暗示CETIF6a未来有望被开发成兼具成像和功能调控的双功能治疗诊断分子。该图的核心结论是：CETIF6a靶向的蛋白在结构上具有聚类特征，且与关键致癌信号通路蛋白ERK1的结合位点具有潜在的功能调控价值。
4 结语：从“看得见”到“看得清、看得懂”
这项研究的意义超越了单一探针的研发。它首次系统性地回答了“肿瘤寻靶染料究竟如何工作”这一关键科学问题，建立了一套从分子设计、性能筛选、靶点鉴定到机制解析的完整研究范式。
CETIF6a的成功，不仅在于它是一个性能优异的术中成像工具，更在于它为我们打开了一扇“分子窗口”——让我们能够“看到”肿瘤的分子特征，理解其内在逻辑。这为未来设计更高特异性、更强功能的探针，乃至开发兼具诊断与治疗功能的“诊疗一体化”分子，提供了宝贵的蓝图和理论基础。
未来，研究者将继续优化CETIF6a的结构，以期在肝癌、胃癌等效果欠佳的癌种中实现突破，并探索其在靶向治疗领域的应用潜力。我们有理由期待，这项技术最终能走进手术室，成为外科医生的“透视眼”，为更多癌症患者带来精准治疗的希望。
本文中所有SDS-PAGE凝胶的荧光实验和玻片染色实验的成像检测图像均为我公司的 Sapphire FL 激光扫描成像系统所采集。
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-026-75356-3
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