---------旭月（北京）科技有限公司 供稿

非损伤性扫描离子选择电极技术及其在后基因组时代的应用

许越^1,2,3) Joseph G. Kunkel³⁾ Alan Shipley⁴⁾ 张平⁵⁾ 王世强⁶⁾

张旭家⁷⁾ 何奕昆⁸⁾ 印莉萍⁸⁾ 杨黄恬⁹⁾ 上官宇¹⁾ 叶鑫生¹⁰⁾

( ¹⁾美国扬格公司，YoungerUSA Company, P.O. Box 37106, Raleigh, NC 27627 USA

²⁾Department of Botany, North Carolina State University, Raleigh, NC 27695 USA

³⁾Vibrating Probe Facility, University of Massachusetts, Amherst, MA 01003 USA

⁴⁾Applicable Electronics Inc., P.O. Box 589, Forestdale, MA 02644 USA

⁵⁾Department of Physiology, Yale University, New Haven, CT 06520 USA

⁶⁾北京大学生命科学学院，生理学与生物物理学系/生物膜与生物工程国家重点实验室，

北京 100871

⁷⁾中国科学院生物物理所，生物大分子国家重点实验室，北京 100101

⁸⁾首都师范大学，生命科学学院， 北京 100037

⁹⁾中国科学院上海生命科学研究院/上海第二医科大学健康科学研究所, 上海 200025

¹⁰⁾国家自然科学基金委员会，生命科学部，北京 100085 )

摘要 非损伤性扫描离子选择电极技术(Scanning Ion-selective Electrode Technique: SIET‘读音:斯爱特’)在不接触被测生物样品－即：在保持被测生物医学样品完整和近乎实际生理环境的状态下，获得进出样品的各种分子和离子的信息。该技术不仅能够测量离子及分子静止状态下的绝对浓度，而且还可以测量它们进出生物样品的运动速率及运动方向。SIET可以围绕被测的单个或多个细胞、组织甚至器官进行灵活、方便而准确的立体测量并获得被测物体周围的离子或分子的三维立体数据。目前，SIET不但可以测量H⁺,Ca²⁺,K⁺,Al³⁺,K⁺,Cd²⁺,Cl^－和O₂，CO₂，NO及温度等参数，而且可以同时采集多种离子及参数，为获得生物样品外分子或离子运动的有关信息提供了良好的实验平台。

关键词 非损伤性电生理技术,离子选择性电极,离子跨膜运输,SIET

中图分类号 Q2, Q6, R3, R4, R9, S1, TB37, X8
　

通讯联系人. Yue (Jeff) Xu, YoungerUSA Co., P.O. Box 37106, Raleigh, NC 27627 USA

E-mail: jeff@youngerusa.com
　

1. 前言
基因组研究后期所面临的一个挑战就是如何理解和确认那些未知的或者人工表达的蛋白质功能，特别是细胞质膜上的离子的运输载体本身的研究，以及由这些蛋白质所产生的众多信息是如何被细胞正确地整合到一起的？非损伤性扫描离子选择电极技术(Scanning IonSelective Electrode Technique: SIET‘读音: 斯爱特’)作为一个综合性较强电生理技术成为迎接这一挑战的理想工具。

SIET技术的核心是离子和分子选择性微电极(以下简称：离子电极)(见图1a)，由Kühtreiber和 Jaffe在1990年设计的一套由计算机控制的自动定位测量系统演变发展而成^[1]。其中Kunkel，Shipley和Karplus于1996年在计算机控制、信号放大和三维测量方面做了较大的改进，并将其定名为SIET。由于SIET能够以非损伤的方式测量到进出生物材料的离子以及分子的运动速率，并随着离子/分子电极种类的不断增多以及电子线路技术和计算机硬件软件的逐步完善，SIET逐渐被应用到基础生物学、生理学、神经生物学、空间生物学、临床医学、基础医学、病理学、毒理学、营养学、农林学及药物机理研究等领域。

尽管，人们通过膜电压的测量，膜片钳技术 ^[2,3,4]，及与显微技术相结合的荧光感染料技术的应用，获得了一些有关离子分布和运动的情况，但是，SIET技术作为对上述几项技术的一项重要补充，并以其特有的时间和空间分辨率，为鉴定或验证某些生物膜运输系统的功能提供了非常有力的工具(见图1b)。在这篇综述里，我们将介绍SIET的基本原理、方法、局限性及其在各个研究领域中的应用状况。

Fig.1 Ion-selective electrode and temporal / spatial resolutions of SIET.

图1离子选择性电极和SIET时间和空间分辨率分布。

(a)Ca²⁺电极的显微照片，LIX(Liquid Ion Excahnger液体离子交换剂)；(b)SIET作为一个开放式的实验平台，在生物医学研究过程中，较好的填补了整体组织研究过程中通过较慢的化学痕量方法(B)，与较快的通过染料标记或膜片钳等局部研究方法(A)两者之间的技术空白。
2. SIET原理
2.1. 物理学及数学基础
物质在液体环境中有从高浓度到低浓度扩散的趋势。对于带电粒子而言，还有从高电化学电势到低的电化学电势运动的趋势。如果，离子电极的移动距离dx在几十微米以下，生物材料实验证明，影响带电粒子运动的电化学电势的梯度可以忽略不计，那么，该离子的扩散运动速率可以通过Fick第一扩散定律计算出来(见图2)。为方便理解，读者可到美国扬格公司网站观赏SIET原理电影动画 (http://www.youngerusa.com/movies/SIET/)。

Fig.2 Physics and mathematic theory of SIET using Ca²⁺ diffusion gradient and Ca²⁺ selective microelectrode as examples.

图2 以Ca²⁺浓度梯度和Ca²⁺电极为例说明SIET的物理学及数学原理。

离子选择性电极由玻璃微电极，Ag/AgCl导线，电解质(100mM CaCl₂)及液态离子交换剂(LIX)四部分组成。该电极在待测离子浓度梯度中以已知距离dx进行两点测量，并分别获得电压V₁和V₂。两点间的浓度差dc则可以从V₁，V₂及已知的该电极的电压/浓度校正曲线计算获得。D是离子/分子特异的扩散常数(单位:cm^-2 sec^-1)，将它们代入Fick的第一扩散定律公式： J_o = - D dC/dx ，可获得该离子的移动速率(单位：pmol cm^-2 sec^-1)，即：每一秒钟通过一个平方厘米的该离子/分子摩尔数 。
2.2. 电子学
SIET系统同时向用户提供两种前置放大器，极谱前置放大器和电压前置放大器(见图3)。极谱前置放大器是配合金属电极的一种前置放大器，如铬白金合金电极(用于测量O₂和H₂O₂等)或碳丝电极(用于测量NO等)，有关金属和碳丝电极的制作和工作原理将在未来的SPET(读音:”斯派特”。SPET:Scanning Polarographic Electrode Technique)技术综述中加以介绍。电压前置放大器是用来配合本文详细介绍的离子选择性电极^[5]。尽管两种放大器所使用的电极及其工作原理不同，但它们测量分子和离子流动速率的原理和方法是相同的。因此，它们可以共享后续的电子电路以及计算机软件系统。值得一提的是，SIET系统具有两个放大器通道，可以将极谱前置放大器和电压前置放大器进行任意形式的组合并进行同时测量，在SIET的应用部分(3.1)将举例介绍如何利用这一优势对生物材料进行O₂(利用极谱前置放大器)和H⁺(利用电压前置放大器)的同时测量。

Fig.3 Polarigraphic pre-amplifier and voltage pre-amplifier of SIET system.

图3 SIET系统极谱前置放大器和电压前置放大器电子线路简图。
2.3. 离子电极的灵敏度及时间分辨率
2.3.1.灵敏度
如同其他任何电生理技术一样，SIET的最终灵敏度还是要取决于电极尖端LIX的高阻抗而产生的热力学电子噪音(Johnson噪音)。SIET通过大于10赫兹的采样频率和1到10秒内的数字化平均值来降低系统噪音,使SIET的灵敏度能够接近理论极限^[6]。

2.3.2.时间分辨率
如图2所示，离子选择电极在V₁和V₂位置停留的时间通常为1到10秒，而且测得离子流动速率J_o至少需要测量两点的数据，决定了SIET技术的时间分辨率。另外的原因还包括：

a) 如果离子电极移动过快将使被测样品周围的溶液受到干扰而破坏离子梯度。电极的移动大致要占去一个测量周期的10%到20%。因此，如果被测离子梯度较大的话，可以通过缩短dx来提高SIET的时间分辨率。

b) LIX需要一定的时间稳定下来，否则，它的测量效率将受到影响，最终导致实验数据的不准确。

2.4. 计算机技术及系统集成
SIET的诞生，发展与完善与计算机技术的不断进步是密不可分的。尽管，计算机需要同时控制三维运动系统，显微成像系统和信号放大系统三个子系统(见图4)，但由于离子选择电极相对较低的时间分辨率要求(2.4.2)，使得普通的个人电脑也可以完全胜任。这为SIET的普及和发展提供了很好的现实基础。

Fig.4 Schematic diagram of SIET system.

图4 SIET系统组成。

(a)组成SIET系统的三大亚系统；(b)SIET系统分解图。

2.5. 影响SIET正确使用的主要外部因素 2.5.1.缓冲溶液中离子流动速率的测量
在使用SIET技术过程中，通常要在溶液中加入一些缓冲剂成份，如：MES，Tris或EDTA等，用以稳定被测离子以便离子选择电极进行测量。然而，如果离子缓冲剂选择或者使用不当，被测离子会与缓冲剂相互干扰，破坏被测离子的浓度梯度或者被大幅度压缩，从而严重影响到SIET的应用效果。Kunkel等人通过系统地比较试验，寻找到了一些最适合于SIET技术的溶液pH缓冲剂及其使用方法，并以实际生物材料的研究证明通过使用这些方法可以将SIET测知离子流动速率的能力达到最大化^[8]。因此，在SIET试验设计过程中，不但要考虑到测量溶液中各种成份对被测样品生物活性的影响，还要充分考虑到缓冲剂成份对被测离子梯度的作用以及对LIX有无严重干扰。

2.5.2.空间几何构型的影响
在现有的1-2微米直径的离子电极，电极距被测材料2-20微米及dx在5-30微米的技术条件下，被测材料离子流动的空间几何分布可以大致分为三类：点，平面及球体。在离子电极距被测材料小于5微米时，通常认为离子是以平面方式运动。

值得一提的是，SIET是目前世界上唯一能够按照研究人员的设定，以手动或编程的方式，用任意角度(相对于被测物体表面)用离子选择电极对被测样品进行测量的系统。经典的利用SIET灵活的空间测量方式的例子是，Kunkel等人对植物花粉管生长过程中，尖端Ca²⁺内流的研究。他们不但能够测量出Ca²⁺的内流速率，而且还计算出该花粉管尖端一个圆盘式的结构是Ca²⁺进入区域的形状(见图5) ^[8]。

Fig.5 Spatial structure was determined by the 3D data collected from SIET (based on [8], 1999).

图5 SIET系统强大的空间测量方式帮助Kunkel等人推断离子进出的空间构型(根据文献[8]的图修改)。

(a)NOD因子引发较对照多一倍的Ca²⁺内流；(b)由于采取特殊的空间测量方式，所测的得离子流动方式证明Ca²⁺内流的区域是一个圆盘状。

2.6. SIET的数据分析
自从SIET诞生以来，在数据分析方面一直是其较为薄弱的环节，在一定程度上也制约了SIET的推广和应用。这主要是由于各个实验室在离子电极的制作、电极的校正、电极的测量效率、电极相对于被测材料的位置、电极的运动方式定义以及缓冲溶液成份方面存在着或多或少的差异。而且，即使在同一实验室，由于某一因素的改变就将对最后的结果产生影响，从而很容易在数据分析上造成偏差，甚至错误^[9]。

许越等人针对上述问题，最近在SIET数据分析标准化方面做了一些尝试(见图6)^[10],并设计了一套Internet多用户共享的数据分析软件-MageFlux(http://youngerusa.com/mageflux)。

Fig.6 MageFlux: Web-interfaced SIET data analyses and 3D display software (based on [10], 2005).

图6.SIET数据分析标准化网上数据分析软件MageFlux-项目建立页面(根据文献[10]的图修改)。

(a)项目名称及说明；(b)电极相对于被测材料的空间位置；(c)以显示器为基准，电极的3维运动方向符号的选择以及电压差的计算方式；(d)不同离子电极的一些固有常数，如：离子扩散系数D₀，离子电极测量效率eff，以及随试验不同而有所变化的部分，如：测量浓度梯度两点间的距离dr(图2中的dx)，通过电极静态校正获得的斜率(Slope)和截距(Intercept)。
MageFlux通过将试验参数利用计算机软件进行跟踪和管理，不但将SIET数据的分析过程标准化，而且还可以将数据以三维动态交互式的形式展现在科研人员面前，真正将SIET技术的空间灵活测量方式体现了出来，并且为离子流动进出被测材料的精确定位提供了最直接和形象的依据。

3. SIET的应用
近年来，SIET为在生命科学各个方面的深入研究提供了一个崭新的工具。在扬格公司的网站(http://youngerusa.com/en/publications/siet.php)有较为全面的文献可供检索。鉴于本综述目的在于介绍SIET技术，应用SIET进行的具体科学研究请见相应的文献。在这里我们将重点介绍SIET技术应用的各个方面。读者还可以到扬格公司网址(http://youngerusa.com/NY/chinese/basics/04sanya_talk.php)，收看许越在2004年全国生物膜与重大疾病学术讨论会上有关SIET演讲的实况录像。

3.1. 植物生理学
SIET在植物学研究中的应用，在该技术的诞生以及发展过程中始终占有相当大的比例。这可能与植物细胞外的细胞壁对向膜片钳这样的技术来讲操作较为困难有关。而利用SIET特有的非损伤性特点，可以在不对细胞、组织甚至器官造成任何损伤的情况下测知离子分子的运输情况。正是意识到SIET的这一优势， Kochian等人在原有的Ca²⁺选择电极的基础上，又相继开发出了H⁺，K⁺，Al³⁺和Cd²⁺离子选择性电极，并将其应用于玉米根和植物毒理学的研究，并为这些电极在动物研究中的应用开辟了道路 ^[6,11,12]。随后，SIET技术被应用于整体根、根毛及花粉管的研究，阐明了诸如钙离子运输与样品内部活动及生长的相关性^[8,13-17]。Messerli等人与1999年的出色SIET应用，将脉动式的花粉管生长所体现的周期，与离子流动速率表现出的频率相互联系了起来^[18]。

图7是许越等人应用SIET特有的多电极同时测量功能，研究H⁺和O₂在百合花粉管生长过程中的变化(文章准备中)。

Fig.7 Simultaneous measurement of H⁺/O₂ fluxes.

图7 H⁺和O₂流动速率的同时测量。

(a)显微照片显示金属氧电极与玻璃H⁺电极同时测量百合花粉管生长过程中H⁺和O₂进出的变化；(b)在花粉管线粒体密集区域, 或称固有碱化带(Constitutive Alkaline Band)区域，同时存在的H⁺外流和O₂内流。

3.2. 哺乳动物发育生物学
对于哺乳动物受精卵及胚胎的研究充分体现了SIET的非损伤性技术优势，即：SIET不但可以测知离子运输的基础生理学过程，以帮助我们认识生物发育过程中动态的离子调控机制，而且还可以作为器官移植前器官功能的检测工具。该检测是依据冻融两细胞阶段老鼠胚胎的Ca²⁺流动速率与随后的胚胎形态变化及发育是密切相关的研究结果^[19,20]。Trimarchi等人对老鼠blastocyts做一个生理状况检查，首先监测Ca²⁺的流动情况，随后把它移植到一个假孕受体里。9天后，12个测试过的blastocyts产生出了11只健康的老鼠。(见图8)^[21].

ig.8 Application of SIET generates little effects on blastocysts and development afterwards (based on [21],2000).

图8 应用SIET技术测量blastocysts对于它们的后续发育并无影响(根据文献[21]的图修改)。

(a)blastocyst周围Ca²⁺速率的测量。内插图: Ca²⁺电极与被测胚胎细胞；(b)新出生的黑色幼鼠(B6C3F1)。这些幼鼠在blastocyst阶段经过SIET技术测量后被移植到假性怀孕的白鼠体中.
3.3. 生理学
肌肉可以产生运动的特性使得许多生理学技术，特别是需要插入细胞内的电极技术，对于它们都一筹莫展。可喜的是，SIET技术的非损伤性，为其在研究肌肉运动中的缓慢过程提供了用武之地。Pelc et al.利用SIET技术测量到了 (Mytilus edulis ，一种软体动物) 平滑肌在carbachol刺激下收缩时大量的Ca²⁺内流。其值高达80 pmolcm^-2s^-1 而且是在 1 mMCa²⁺背景浓度的条件下测得的 ^[22]。Pelc et al.还成功的从单个离体的肌细胞myocytes测量到了Ca²⁺流动 ^[23]。

在Leah Devlin等人的研究中较容易地测量到了Sclerodactyla briareus (Sclerodactyla briareus 是一种海参，它名字是不慌不忙的意思)平滑肌在神经介质和激素刺激的下产生的Ca²⁺外流(见图9)^[24-26]。

Fig.9 Ca²⁺ effluxes with neural transmitter and hormone (based on [26], 2003).

图9平滑肌在神经介质和激素刺激的下的Ca²⁺外流变化(根据文献[26]的图修改)。

(a) Muscarinic AchR antagonists (10–6 M) himbacine (M2,4)对Ca²⁺ 外流的促进作用。M in ASW：肌肉自发的Ca²⁺ 流动,ASW(artificial Ca²⁺-free seawater); M in himbacine：在himbacine诱导下的Ca²⁺ 流动；背景信号 (BG): Ca²⁺离开材料500微米所取得的信号。(b) The Ca²⁺ release agonists, caffeine(10–6 M) 对Ca²⁺流动的影响。
应该指出的是，在诸如verapamil和diltiazem(L-type channels) Co²⁺and La³⁺ 拮抗剂不存在情况下，SIET测量不到Ca²⁺ 速率信号变化。

这一点在应用SIET技术时需要十分注意。因为SIET技术的工作频率在(0.1–10 Hz)之间，快速的离子变化SIET是检测不到的，即使测到也将是瞬时的。因此，SIET技术不适合于检测离子通道，而适合那些相对较慢的运输机制，比如，与膜紧密相连的ATPases，以及一些不宜于被其他技术研究的系统。因此SIET的测量结果是运输载体活性的反映，或膜运输过程的结果，而不是单独个别运输载体的活性。

台湾中研院应用SIET系统并结合显微荧光染色技术对鱼类卵黄细胞在从淡水到海水的双向转换过程中，氯离子细胞(ChlorideCells)吸收和释放氯离子过程进行研究，为阐明迁徙鱼类的离子调节机制提供了有利证据(见图10)。

Fig.10 Combination usage of SIET with fluorescence microscopy.

图10 SIET结合荧光显微技术的SIET应用。

通过荧光染色定位Talipia(卵黄细胞yolk cell)氯细胞（左上）。鱼鳃细胞荧光染色(B)及其对照(A)。Ca²⁺和Cl^-双电极测量(右上)。 SIET的XZ平面测量(右下)。
美国麻省BayState医院利用SIET对影响人体干细胞(StemCells)保存期限的若干外部环境及细胞内部因素进行研究，试图克服由于冷冻造成的高达50％以上的损失率，为人体细胞培养，分化研究及人体器官再生扫清技术障隘(个人通讯)。

3.4. 神经生物学
在神经组织中，维持Ca²⁺浓度平衡、局部区域的反应及调控是极为重要的，如信号整合及临床状况等等 ^[27]。SIET技术在神经生物学的应用为研究运输现象开辟了一条崭新的道路。例如，在近乎实时的情况下，在细胞表面的运输过程可以被较全面的记录下来，以及由离子泵和其他运输载体活性所产生的净离子信号^[28,29]。

在单细胞研究中，Ca²⁺ 和H⁺选择电极被应用于研究单个视网膜细胞^[30-35],而Knox等人利用 Aplysiid Bag Cell神经元作为材料研究在ICRAC、自由基、重金属及第二信使存在的条件下，Ca²⁺ 的调节机制^[36,37]。Molina1等人2004年证明H⁺流动存在于skate视网膜细胞神经介质的生理活动中(见图11) ^[38]。

Fig.11 H⁺ flux measurement in skate horizontal cells with SIET (based on [38], 2004).

图11 SIET技术H⁺电极测量分离的skate Horizontal细胞(根据文献[38]的图修改)。

(A)通过酶解方法从skate retina得到的一个细胞。图中左面H⁺电极正在靠近‘near pole’。双箭头代表从近端到远端运动的位置；(B)加入25mM HEPES后H⁺流动减弱了；(C) 8个细胞测量的数据分析。

3.5. 临床医学
在牙齿周围液体中的Ca²⁺浓度是决定一颗牙齿是在再矿化状态还是在去矿化状态的几个关键因素之一^[39]。由于这些Ca²⁺指的是游离的Ca²⁺，而非阴离子结合的Ca²⁺，这就为Ca²⁺电极的应用提供了用武之地。

3.6. 药理学
美国哈佛大学医学研究院的研究人员正利用SIET技术，结合分子生物学方法对ChineseHamsterOvary细胞进行研究，试图了解某些药物的作用机理，阐明某些动物细胞的生化信号传导路径(个人通讯)。 美国北卡WAKE－FOREST医学院MIKE TYTELL教授，应用SIET研究HSP70蛋白对动物神经细胞损伤修复的影响，以奠定HSP70可作为药物的理论基础(个人通讯)。

意大利的Rubinacci骨骼代谢研究所最近成功地利用SIET对Ca²⁺在骨中的代谢过程进行研究，不但证明了骨具有瞬时释放Ca²⁺能力，而且为今后利用骨作为药物测试的模式系统铺垫了道路(见图12)(论文在审阅过程中)。

Fig.12 Ca²⁺ activities in bone metabolism process measured by SIET.

图12. SIET测量骨骼Ca²⁺释放过程。

(a)显微照片显示跖骨metatarsal、穿过皮层cortex的穿孔及Ca²⁺电极；(b)当细胞外液(ECF)被不含Ca²⁺的细胞外液置换后，Ca²⁺在几分钟之内从内流转变为外流。靠近时间轴的数据为背景 对照；(c) 14次重复试验的数据分析。
3.7. 传染病学
美国麻省州立大学生物系KUNKEL教授利用SIET微测系统，对蟑螂体内的某一寄生虫的产生和发育过程进行研究，试图了解该寄生虫引发儿童哮喘病的机理(个人通讯)。

3.8. 细胞生物学
Vincent等人在鉴定出拟南芥菜磷脂酰肌醇转运蛋白族(Phosphatidylinositol transfer proteins (PITPs))的一种成份AtSfh1p之后，将显微荧光技术与SIET结合使用，从内部和外部同时证明AtSfh1p在根毛顶端生长过程中，具有调节细胞内和质膜磷酸肌醇极性运输，Ca²⁺信号传递和细胞骨架的功能。在植物细胞的极性生长机理研究方面向前推进了一步(见图13)^[40]。

Fig.13 AtSfh1p deficiency Arabidopsis Ca²⁺ transportation in root hairs (based on [40], 2005).

图13 AtSfh1p缺失拟南芥菜根毛的Ca²⁺信号传递异常(根据文献[40]的图修改)。

(A)Ca²⁺内部梯度.Ca²⁺浓度荧光显微结果(左)野生型(右)突变体。(B)利用SIET测得的外部Ca²⁺流动情况。图中箭头同时代表Ca²⁺流动的方向和大小。(C)SIET15次独立试验结果的数据统计。
3.9. 环境科学
浮萍(Duckweed)具有积累和聚集水环境中重金属离子（如：镉）的作用，但其作用机理却存在争论，一方面认为浮萍本身具有吸收重金属的功能，另一方面认为是与其共生的微生物使然。麻省州立大学微生物系(http://www.bio.umass.edu/micro/nusslein/stout.htm)应用SIET和Cd²⁺离子电极对该过程进行研究，有望为这一争议提供新的有力证据。

3.10. 农业科学
新西兰农业科学院利用SIET技术进行高吸收磷植物品种的筛选，试图为改善植物品种摸索出一条新思路(个人通讯)。

土壤颗粒表面的离子组成及与周边环境间的相互作用，对于土壤的性质起着决定性作用。SIET系统将为研究土壤颗粒的这一特性提供了非常直接和有效的手段(个人通讯)。

3.11. 太空生物学
北卡罗来纳州立大学植物系NSCORT研究组受美国航空航天局资助，研究植物感知重力的遗传及生理机理，通过对重力非敏感的拟南芥菜突变体的研究，许越等人发现植物根部在相对于地球重力不同的位置的情况下，其H⁺和Ca²⁺的流动在根部的不同位置呈现出不同的变化，显示出H+和Ca²⁺可能在植物感知重力变化的过程中扮演一定的角色(文稿准备中)(见图14)。

Fig.14 Simultaneous Ca²⁺/H⁺ measurement of ARG1 mutant.

图14 利用SIET对重力非敏感植物突变体Ca²⁺及H⁺变化的同时测量。

(a)ARG(Altered Response to Gravity)拟南芥菜突变体及其野生型WS(拟南芥菜Wassilewskija品系)；(b)ARG在重力变化刺激下的 Ca²⁺及H⁺变化与野生型对照有明显的区别；(c)针对植物重力研究而特殊设计的试验系统。
3.12. 金属腐蚀研究
某种单一离子流动对金属腐蚀的影响已被越来越多的科研人员所关注。刚刚开始的这方面研究和数据的积累必将对金属腐蚀机理的阐述具有深远的意义(个人通讯)。

4. 总结及展望
SIET在借鉴众多科学家工作经验的基础上，经过多年的改进和完善，为科研人员提供了一个较为友好的软硬件环境，在数据的生成，采集以及校准等方面，极大地方便了研究人员。特别是应用SIET强大的3维立体测量方式，研究人员可以获得其他电生理技术无法测到的被测样品某些点的特异活性 ^[10]。

对于较为熟悉膜片钳技术的科研人员来讲，SIET是一个与膜片钳无论在时间分辨率还是在空间分辨率上不同的技术（如图1b），但由于膜片钳技术似乎在研究离子通道之外，作为十分有限，两者在研究过程中可以极好的相互补充。

由于SIET技术的出现，人们对于生物体特异离子转运系统的研究，在灵敏度上，时间和空间分辨率上已经被大大地提高了，并已成熟地与细胞和分子生物学技术、其他电生理技术和显微荧光成像技术配合使用(见3.5和4.10)。大家普遍认为SIET技术将在主动运输离子或分子泵和协同运输载体的研究方面发挥重大的作用。

分子遗传学的进展使得我们能够对这些运输载体分子加以确定，克隆和进行可控制的表达。当这些运输载体在分子水平方面通过在酵母，卵细胞等系统中的表达予以鉴定，或者某些细胞成份的物理结构和生理功能阐明之后^{[41,42,43,44]}，SIET技术的非损伤性，多离子/分子同时测量及灵活的空间测量方式将在细胞和组织水平上的功能鉴定方面发挥重要的，甚至是无法替代的作用。

5. 致谢
特别感谢匡廷云院士在身患重病的情况下对SIET技术的关心与支持。感谢杨福愉院士和林克椿教授给予的指导性建议。

同时感谢与裴真明教授(Department of Biology, Duke University, Durham, NC 27708)、王兆一教授(Creighton Cancer Center,1912 California St,Omaha, NE 68178)、许华曦教授(Center for Neuroscience and Aging, The Burnham Institute, La Jolla, California)、刘平生教授(Univ. of Texas Southwestern Medical Center at Dallas)、公衍道教授和隋森芳教授(清华大学生物科学与技术系)、徐涛教授，赫荣乔教授，沈钧贤教授，黄有国教授(中国科学院生物物理所)、武维华教授(中国农业大学生物学院植物生理学与生物化学国家重点实验室)、崔宗杰教授(北京师范大学细胞生物学研究所)、曾争主任医师(北京大学第一医院感染疾病科)、 黄海长研究员(北京大学第一医院肾脏内科-北京大学肾脏病研究所)、高天明教授(南方医科大学)、高永雄教授(香港中文大学)、林澧仪(台湾中央研究動物所)有关SIET技术所作的有益的探讨。

对Applicable Electronics Inc.和Science Wares Inc.的资金和技术支持表示感谢。

6. 参考文献
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Non-Invasive Scanning Ion-selective Electrode Technique and

Its Applications in the Post Genomic Era

Yue Xu^1,2,3) Joseph G. Kunkel³⁾ Alan Shipley⁴⁾ Ping Zhang⁵⁾ WANG Shi-Qiang⁶⁾

ZHANG Xu-Jia⁷⁾ HE Yi-Kun⁸⁾ YIN Li-Ping⁸⁾ YANG Huang-Tian⁹⁾ SHANGGUAN Yu¹⁾

YE Xin-Sheng¹⁰⁾

( ¹⁾YoungerUSA Company, P.O. Box 37106, Raleigh, NC 27627 USA

²⁾Department of Botany, North Carolina State University, Raleigh, NC 27695 USA

³⁾Vibrating Probe Facility, University of Massachusetts at Amherst, Amherst, MA 01003 USA

⁴⁾Applicable Electronics Inc., P.O. Box 589, Forestdale, MA 02644 USA

⁵⁾Department of Physiology, Yale University, New Haven, CT 06520 USA

⁶⁾Department of Physiology and Biophysics, State Key Lab of Biomembrane and membrane Biotech,

Peking University College of Life Sciences, Beijing 100871

⁷⁾National Laboratory of Biomacromolecules, Institute of Biophysics, Chinese Academy of Sciences,

Beijing 100101

⁸⁾College of Life Science, Capital Normal University, Beijing 100037

⁹⁾Institute of Health Science, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of

Sciences & Shanghai Second Medical University, Shanghai 200025

¹⁰⁾Department of Life Sciences, National Natural Science Foundation of China, Beijing 100085 )

Abstract The SIET non-invasively measures both ionic concentrations and ionic fluxes in aqueous media with a spatial resolution of less than 10 micrometers with picomolar sensitivity. The SIET measures the extracellular fluxes in and out of living biological membranes in-vitro. Ca²⁺, H⁺, Cl^-, K⁺, Cd²⁺, Al³⁺, Mg²⁺, O₂ and NO are some of the ions/molecules that can be measured at present, and more ion and molecular species will be available in the near future. Some of the many applications of this technique for example, ionic flux measurements in both animal and plant cells demonstrate the unique advantages of the SIET compared to other techniques. The SIET can measure extra-cellular ion movement in such a way that it provides information that has been only theoretical.

Keywords non-invasive electrophysiology technique, ion-selective electrode, ionic transmemberane transportation, SIET

Corresponding Author. Yue (Jeff) Xu, YoungerUSA Co., PO Box 37106, Raleigh, NC 27627 USA, E-mail: jeff@youngerusa.com

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