SiRNA在电转染实验中的要求
2024-07-13 来源:威尼德生物科技 点击次数:551
一、引言
二、siRNA 自身特性的要求
（一）纯度与质量
（二）浓度范围
三、与电转染参数的适配性
（一）电场强度适配
（二）脉冲宽度与次数的协调
四、细胞相关因素的要求
（一）细胞类型与状态
（二）细胞密度的调节
五、实验环境的要求
（一）缓冲液的选择
（二）温度控制
六、结论
二、siRNA 自身特性的要求
（一）纯度与质量
- 化学纯度
- siRNA 制备过程中应尽量去除杂质，如未完全合成的寡核苷酸、盐离子、有机溶剂等。高化学纯度的 siRNA 能确保其在电转染过程中与细胞膜及细胞内成分的稳定相互作用，避免杂质对转染效率的干扰。
- 例如，采用高效液相色谱（HPLC）等先进的纯化技术，可以获得纯度高达 95% 以上的 siRNA，有效提高电转染效果。
- 序列特异性
- siRNA 的序列必须严格设计，以确保其特异性地靶向目标基因。避免与其他非靶标基因的同源序列结合，从而减少脱靶效应的发生。
- 通常，在设计 siRNA 序列时，会利用生物信息学工具进行严格筛选，并通过实验验证其特异性。
（二）浓度范围
- 最佳浓度确定
- siRNA 的浓度在电转染实验中需要进行优化。浓度过低可能导致基因沉默效果不显著，因为进入细胞内的 siRNA 分子数量不足以有效抑制靶基因的表达。
- 一般来说，在大多数细胞类型中，siRNA 的浓度范围在 10 - 100 nM 之间，但不同细胞系和实验条件下可能有所差异。
- 浓度过高的影响
- 过高的 siRNA 浓度可能会引发非特异性的基因沉默或细胞毒性。过多的 siRNA 分子可能会与细胞内的非靶标 RNA 结合，或者干扰细胞的正常生理过程。
三、与电转染参数的适配性
（一）电场强度适配
- 避免细胞损伤
- 电转染过程中的电场强度需要根据 siRNA 的特性进行调整。过高的电场强度可能会导致细胞膜过度穿孔，使细胞内环境紊乱，影响 siRNA 发挥作用。
- 例如，对于一些敏感细胞，当电场强度超过 800 V/cm 时，细胞的存活率会显著降低，同时 siRNA 的转染效率也会受到影响。
- 确保有效转染
- 合适的电场强度能够促进细胞膜形成适宜大小和数量的孔隙，便于 siRNA 进入细胞。通常在 200 - 600 V/cm 的电场强度范围内，siRNA 可以高效地进入细胞。
（二）脉冲宽度与次数的协调
- 脉冲宽度的影响
- 脉冲宽度决定了细胞膜孔隙的持续时间。对于 siRNA 转染，较窄的脉冲宽度（如 1 - 10 μs）可以减少细胞损伤，但可能需要多次脉冲来保证足够的 siRNA 进入细胞。
- 例如，在某些实验中，采用 5 μs 的脉冲宽度，配合 3 - 5 次脉冲，可以在不显著影响细胞活力的情况下，提高 siRNA 的转染效率。
- 脉冲次数的考量
- 增加脉冲次数可以增加 siRNA 进入细胞的机会，但过多的脉冲次数会对细胞造成累积性损伤。因此，需要在转染效率和细胞活力之间进行平衡。
四、细胞相关因素的要求
（一）细胞类型与状态
- 不同细胞类型的差异
- 不同的细胞类型对 siRNA 电转染的敏感性不同。例如，肿瘤细胞与正常细胞在细胞膜组成、细胞内信号通路等方面存在差异，这导致它们对电转染的参数以及 siRNA 的摄取能力有所不同。
- 如在某些肿瘤细胞系中，由于细胞膜上特定受体的高表达，可能更容易摄取 siRNA，从而在相对较低的电转染参数下就能实现较好的基因沉默效果。
- 细胞生长状态的影响
- 处于对数生长期的细胞通常具有较高的活力和较好的细胞膜通透性，更适合进行 siRNA 电转染实验。而处于静止期或衰老期的细胞，其细胞膜结构和细胞内环境可能不利于 siRNA 的摄取和作用。
（二）细胞密度的调节
- 最佳细胞密度范围
- 细胞密度在电转染实验中至关重要。过高的细胞密度会导致细胞之间的电场分布不均匀，影响 siRNA 的转染效率；过低的细胞密度则会降低实验效率。
- 一般情况下，细胞密度在 1×10⁶ - 5×10⁶ 个细胞 /mL 范围内较为适宜，但不同细胞类型和电转染设备可能需要进行微调。
- 密度对转染均匀性的影响
- 合适的细胞密度可以保证每个细胞在电转染过程中受到相对均匀的电场作用，从而提高 siRNA 转染的均匀性和可重复性。
五、实验环境的要求
（一）缓冲液的选择
- 离子强度的影响
- 电转染缓冲液的离子强度对 siRNA 转染效率有显著影响。合适的离子强度可以稳定细胞膜电位，促进细胞膜穿孔，同时减少细胞损伤。
- 例如，使用离子强度在 10 - 15 mM 的缓冲液，可以提高 siRNA 在电转染过程中的稳定性和转染效率。
- pH 值与渗透压的适配
- 缓冲液的 pH 值应接近细胞的生理 pH（7.2 - 7.4），以保证细胞的正常生理功能和 siRNA 的活性。同时，缓冲液的渗透压也需要与细胞内环境相匹配，避免细胞吸水或失水。
（二）温度控制
- 预冷处理的重要性
- 在电转染前，将细胞和 siRNA 混合液在冰上预冷一段时间（如 10 - 15 分钟）可以降低细胞代谢活性，减少细胞在电转染过程中的损伤。
- 转染过程中的温度稳定
- 在电转染过程中，保持温度相对稳定也非常关键。温度过高或过低都会影响细胞膜的流动性和孔隙的形成，从而影响 siRNA 的转染效率。
六、结论
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