外泌体是细胞释放的纳米级（30–150 nm）囊泡，携带蛋白质、脂质、mRNA、miRNA、lncRNA等生物分子，在细胞间通讯、免疫调节、组织修复及疾病进展中发挥关键作用。外泌体固有低免疫原性、良好的生物相容性以及穿越血脑屏障等特点，其也被视为极具潜力的无细胞治疗载体。然而，天然外泌体通常缺乏对靶向识别能力，内含物组成不可控，治疗效能有限，甚至在某些情况下（如肿瘤来源外泌体）可能促进疾病进展。因此，为提升其临床应用价值，需通过内源性工程策略——即对外泌体来源细胞进行改造，使其生成具备靶向性、增强治疗功能或可控载荷的工程化外泌体。

目前的内源性改造方案主要包括：
（1）在母细胞中表达融合膜蛋白（如Lamp2b-靶向肽），使外泌体表面天然展示特异性配体以实现归巢；
（2）调控母细胞内治疗性核酸或蛋白的表达，并利用内源分选机制将其高效装载入外泌体；
（3）敲除或抑制母细胞中与免疫抑制、促转移相关的基因，消除外泌体的潜在毒性。

通过上述方法进行工程化改造的外泌体，为肿瘤、神经退行性疾病、自身免疫病等重大疾病的无细胞疗法开辟了新路径。

研究案例
①研究人员通过基因工程改造树突状细胞，使其分泌一种表面展示Fc-Lamp2b-RBD融合蛋白的外泌体。该设计结合了Fc片段介导的肺部靶向投递能力（通过FcRn受体）与RBD抗原的免疫激活功能。经气管接种后，这种外泌体疫苗能高效穿过肺黏膜，在小鼠体内激发强大的全身与黏膜免疫应答（包括特异性抗体和Th1细胞免疫），并有效抵抗假病毒攻击。该研究为开发呼吸道黏膜疫苗提供了新策略[1]。

②该研究通过基因工程手段，将肿瘤归巢穿透膜肽tLyp-1与lamp2b构建为融合质粒，并转染HEK293T。靶向tLyp-1外泌体从转染HEK293T细胞分泌物中分离出来。随后，再通过电转染将siRNA封装到靶向tLyp-1外泌体中。结果显示，靶向siRNA tLyp-1的外泌体在肺癌和癌症干细胞中转染效率极高，能够沉默癌细胞中的SOX2基因，并降低癌细胞干细胞的干性[2]。

③神经生长因子（NGF）在治疗脑缺血等中枢神经系统疾病方面潜力显著，但其临床应用面临血脑屏障阻碍和体内快速降解两大挑战。改研究开发了一种基于工程化外泌体的新型递送策略：将靶向肽RVG与外泌体膜蛋白Lamp2b融合，构建出能够穿越血脑屏障的RVG-Lamp2b外泌体，并成功将重组人NGF蛋白及其mRNA共同装载其中，形成NGF@ExoRVG。动物实验表明，单次注射该外泌体能高效将NGF递送至缺血脑区，通过减轻炎症、减少细胞死亡、促进小胶质细胞向保护性表型极化及可能增强神经发生，从而发挥神经保护作用[3]。

工程化外泌体的改造策略
工程化外泌体的改造流程通常按以下顺序进行：
①设计靶向分子（如特异性肽段）及治疗性载荷（如siRNA），并构建融合表达质粒；
②选取合适的细胞（如HEK293），通过细胞转染，使细胞表达靶向膜蛋白；
③收集细胞培养上清，利用超速离心、尺寸排阻色谱等方法分离纯化外泌体；
④通过电穿孔、超声等方法将药物、核酸等载入外泌体，必要时再对外泌体表面进行化学修饰以增强靶向性或稳定性；
⑤对工程化外泌体进行粒径、标志物、载药量及功能等全面表征，最后在细胞\动物模型中评估其靶向效率及治疗功效。

ExTransfection：一步整合细胞转染与外泌体载药的高效电转平台
奎克泰生物推出的Extransfection™细胞电转染系统，能以瞬时电脉冲击穿外泌体来源细胞的细胞膜和外泌体膜，从而实现质粒向细胞的递送与内容物（如核酸、蛋白）向外泌体的装载，将两个关键步骤整合于同一系统。该设备在工程化外泌体改造应用中的核心优势体现：

①广泛适配
 适用于多种哺乳动物细胞，包括常用的HEK293、MSCs、iPSCs及各类肿瘤细胞。可递送的分子类型涵盖DNA、RNA及RNP复合物，全面满足从细胞转染到外泌体载物的不同需求。

②高效低损
采用独特的毛细管型电转腔设计，确保电场均匀、集中，能在实现高转染/装载效率的同时，最大程度减少对细胞及外泌体活性的损伤，保障产物得率与质量。

③智能优化
系统预置超过300种细胞类型的转染参数，并支持24/18孔板规模的条件优化实验。用户可快速、系统地摸索并获得针对特定外泌体供体细胞的最佳转染方案。

④稳定可靠
标准化的操作流程与精密的电控系统，确保了实验过程与结果的高度可重复性，为工艺放大和转化研究提供坚实基础。

⑤灵活简便
操作采用“混样-电转-培养”三步法，极大简化人工步骤。系统无缝兼容10μL（条件摸索）与100μL（规模放大）的转染体系，兼顾探索灵活性与制备通量需求。

综上，工程化外泌体作为革命性的无细胞治疗平台，其核心是通过内源性工程策略（如融合膜蛋白设计与母细胞内容物调控）实现精准靶向与高效载药。多领域的成功案例充分印证了该策略的广阔潜力。这一改造流程的标准化与高效化至关重要，而Extransfection™细胞电转染系统通过整合“细胞转染”与“外泌体载药”两大核心步骤，显著提升了效率、可控性与重复性，为研究提供了坚实支持。 随着核心工艺的成熟与优化，工程化外泌体有望加速临床应用，为应对肿瘤、神经性疾病等提供全新的精准治疗方案。

Reference：
[1]Meng F, Xing H, Li J, Liu Y, Tang L, Chen Z, Jia X, Yin Z, Yi J, Lu M, Gao X, Zheng A. Fc-empowered exosomes with superior epithelial layer transmission and lung distribution ability for pulmonary vaccination. Bioact Mater. 2024 Sep 12;42:573-586. doi: 10.1016/j.bioactmat.2024.08.015
[2]Bai J, Duan J, Liu R, Du Y, Luo Q, Cui Y, Su Z, Xu J, Xie Y, Lu W. Engineered targeting tLyp-1 exosomes as gene therapy vectors for efficient delivery of siRNA into lung cancer cells. Asian J Pharm Sci. 2020 Jul;15(4):461-471. doi: 10.1016/j.ajps.2019.04.002
[3] Yang J, Wu S, Hou L, Zhu D, Yin S, Yang G, Wang Y. Therapeutic Effects of Simultaneous Delivery of Nerve Growth Factor mRNA and Protein via Exosomes on Cerebral Ischemia. Mol Ther Nucleic Acids. 2020 Sep 4;21:512-522. doi: 10.1016/j.omtn.2020.06.013