编者按

近年来，单细胞转录组的出现使得研究者的视角从组织水平转向细胞水平，而空间转录组能够给出每一种细胞类型的空间位置信息，这两种技术运用也越来越广泛，包括类器官研究领域。2024年5月13日，复旦大学脑科学转化研究院邵志成研究员团队在 Cell Reports Methods 期刊发表了题为《Effective cryopreservation of human brain tissue and neural organoids》的研究论文。本文章使用单细胞转录组技术解析了冷冻保存和正常类器官中的细胞类型变化，更加有力的证明了冷冻技术的可行性。

Fig.1 类器官单细胞转录组/空间转录组研究思路

01 文章背景

研究脑部疾病新型药物的人力和经济成本非常高，超过90%的脑部疾病候选新药无法真正应用到临床中，其主要挑战之一是将新药从动物模型试验转向人源模型。随着类器官技术的发展，脑类器官在研究人类大脑发育、模拟脑部疾病和开发新药方面展现出了巨大的潜力。然而，需要长期培养的脑类器官由于成本和储存问题极大的限制了其在生物医药研究中的应用，可靠的类器官模型应该具备新鲜人脑的自然病理特征。因此，开发出一种适用于脑类器官/脑组织的低温保存方法对推动脑科学基础和临床转化研究具有十分重要的意义。

02 文章详情

文章题目：Effective cryopreservation of human brain tissue and neural organoids

中文题目：人类脑组织和神经类器官有效冻存新技术

发表时间：2024.5

期刊名称：Cell Reports Methods 

实验平台：10x 单细胞转录组、类器官

DOI：10.1016/j.crmeth.2024.100777

03 研究内容

1. 通过MEDY有效地低温保存人体皮质类器官

研究团队通过精准控制冷冻介质的成分和冻融过程开发了一种新型的低温保存方法。选择了多种具有维持类器官形态完整性、减少神经元细胞死亡/保护轴突生长潜力的冷冻介质的成分。并通过添加小分子抑制剂（Y27632）来提高类器官冻存的保护效果，然后通过对复苏后类器官轴突生长状态、神经元生长状态以及凋亡比例的对比分析，作者最终确定了1%甲基纤维素 + 10%乙二醇 + 10% DMSO + 10 μM Y27632 （MEDY）是脑类器官的最佳冷冻介质。

Fig.2 不同冷冻保存介质对复苏后脑类器官的影响

2. MEDY能够在低温保存后维持皮质类器官的功能活性和细胞多样性

心室区（VZ）样结构和多个皮质层在维持大脑类器官的功能方面发挥着重要作用，其功能结构完好是发展低温保存技术的关键问题。使用MEDY冷冻皮质类器官，解冻后继续培养21天、50天后，类器官功能结构被完全保留，且在低温保存1年半的类器官中祖细胞和神经元依然能够维持良好。通过对类器官进行了bulk转录组测序和单细胞转录组测序证明神经标志物的基因表达谱以及主要的神经细胞亚群没有明显变化。然后通过钙成像技术证明低温保存的类器官仍具有功能性神经元活性，其连通性得到了基本的保护。这些结果进一步表明，MEDY超低温保存不会破坏细胞群多样性、基因表达、细胞空间位置分布以及功能活性。

Fig.3 MEDY保留脑类器官的功能结构、细胞活性

3. 低温保存的类器官的长期培养活性

低温保存技术对长期培养的类器官具有重要的作用。因此作者将培养到77，90，100天以上的类器官使用MEDY冷冻保存，解冻后进一步培养，发现神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞依然能够很好的维持，并且进一步培养依然具有很强的钙活性。这些结果表明，MEDY超低温保存可以用于储存长期培养的皮质类器官。

Fig.4 MEDY超低温保存可用于保护长期培养的皮质类器官和SP类器官

4. MEDY低温保存在多种脑区特异性类器官、脑组织中的应用

使用MEDY培养基将诱导出的背/腹侧前脑（GABA）类器官、脊髓（SP）类器官和视神经（OVB）类器官培养至第30天左右进行冷冻，免疫荧光染色结果标明，这些脑区特异性类器官的细胞多样性和结构同样得到了良好的保存，表明该培养基适用于福哦中脑区类器官的保存。进一步在癫痫患者源性脑类器官以及3D脑组织进行冷冻保存及验证，发现其神经元等细胞保存良好，并且保留了完成的病理结构。说明MEDY可以应用于脑类器官组织和活脑组织的冷冻保存。最后，研究团队通过转录组学分析发现，MEDY通过抑制内质网介导的细胞凋亡途径从而保护突触功能，实现在低温状态下对脑类器官的保护作用。

Fig.5 MEDY低温保存适用于保存癫痫儿童来源的皮质类器官和活脑组织

总之，本研究找到了一种人类脑组织冷冻保存新方法，可以完成脑类器官、脑区域特异性类器官、癫痫患者源性脑类器官以及3D脑组织冷冻保存。对减少神经类器官的制备时间和成本，实现各种神经类器官和活体脑组织的大规模存储提供可能性，并能够有效促进脑科学基础研究、神经类器官移植治疗和药物评估与筛选。

单细胞技术应用于类器官培养后的验证，药物治疗机制，耐药性研究中具有重要的地位，同年四月份在Cell reports发表的题为《Generation of human cerebral organoids with a structured outer subventricular zone》的研究论文，同样使用单细胞转录组技术研究脑类器官对照组和实验组的细胞类型和分子表达谱，为文章研究提供了更精细的分析角度。而单细胞分辨率的空间多组学技术的出现，也许会为类器官的空间分布和原组织的相似性提供更多的验证手段。

类器官研究思路参考