本文要点：近红外二区（NIR-II）荧光成像在肿瘤精准诊断中至关重要，具有更高的分辨率和穿透能力。然而，现有的NIR-II探针要么是“常亮”模式，要么仅响应单一刺激，导致信噪比低和潜在的假阳性问题。本研究提出了一种双锁控制的探针HN-PBA，通过同时响应H₂O₂和肿瘤酸性环境激活荧光信号。这种双重响应机制确保了肿瘤部位的明亮荧光信号，相较于传统的“常亮”探针和仅响应H₂O₂的探针，显著提高了肿瘤与正常组织的对比度（T/NT）。该策略能够精准识别并切除原发性和转移性肿瘤，T/NT比分别达到24.3（原发灶）和6.4（肺转移灶）。该探针还能有效检测直径≤0.7 mm的肺转移灶，并在临床乳腺癌样本中展示了精准病灶定位的能力。这种双重刺激响应策略为未来诊断探针的设计提供了新思路。

开发一种双锁控制的NIR-II荧光探针HN-PBA，用于响应酸性肿瘤微环境（酸性pH/过氧化氢（H₂O₂）的双重刺激。探针有望通过NIR-II荧光成像同时提供高特异性的肿瘤识别和引导手术，用于原发性和转移性乳腺肿瘤（方案1）。探针HN-PBA设计有两个智能“锁”，其核心结构包含两个功能模块。第一锁：硼酸酯基团作为H₂O₂响应位点，通过H₂O₂触发的亲核反应生成硫醇基团，增强分子内电荷转移（ICT）。第二锁：羧酸修饰的罗丹明衍生物通过pH依赖的螺环化机制调节荧光信号。HN-PBA探针在自然状态下显示NIR-II荧光信号“关”。当与两个“钥匙”一起开启时，即在酸性介质中存在H₂O₂时，HN-PBA的硼酸酯可以与H₂O₂发生亲核相互作用，形成过渡中间体，随后水解生成酚羟基，接着发生分子内自消除反应并生成具有强给电子特性的硫醇基团。结果，HN-PBA的NIR-II信号在H⁺/H₂O₂的协同作用下恢复。光谱研究表明，HN-PBA 探针在pH 6.5的酸性溶液中对H₂O₂表现出高灵敏度和特异性响应，最大发射波长为1,060 nm。由于实体瘤环境中H₂O₂水平高且pH值弱酸性，HN-PBA可以选择性地点亮其NIR-II荧光信号，从而实现体内肿瘤的靶向成像和引导干预。鉴于双锁设计策略可以有效减少非特异性响应和“假阳性”信号干扰，双刺激激活探针HN-PBA提供了比“常亮”探针ICG和单生物标志物（H₂O₂）激活探针HN-PBC高8.2/4.0倍的目标与噪声比。此外，HN-PBA探针有效引导了多个微肿瘤的准确切除，确保最小残留阴性切缘低至约0.25 mm。更重要的是，HN-PBA能够精确区分原发性和转移性乳腺病变与周围正常组织，TNT比分别为2.4-3（原发病变）和6.4/5.8（肺转移）。在NIR-II荧光成像的辅助下，直径约0.7 mm的微小肺转移灶可以被有效切除。最后，HN-PBA在临床肿瘤标本的成像中表现出良好的特异性。

接着，研究了HN-PBA在H+/H2O2共刺激下的光学响应。图1a中的吸收光谱显示，在酸性条件下（pH 6.5), HN-PBA在628nm处的吸收下降而在825nm附近出现新的吸收带。然而在生理条件下（pH 7.4），在HN-PBA与H2O2的反应过程中，825 nm处的吸收显著降低，并在480 nm处观察到新的吸收峰。推测这些新峰可能归因于两种形式的反应产物，即HN-PBA-SH（开环，825 nm）和HN-PBA-SS-SH-SR（螺内酰胺，480 nm，方案1）。在808 nm激发下，HN-PBA在1060 nm处的NIR-II荧光信号在H2O2和酸的存在下表现出显著增强（约17.1倍）。相反，当单独存在H2O2（4.1倍）或酸性环境（pH=6.5，0.8倍）时，观察到荧光信号的变化很小（图1b，c）。此外，评估了HN-PBA在H2O2存在下对pH变化的可逆反应（图1d）。1060nm处的NIR-II信号在用不同pH介质连续处理后表现出光学“开启”到“关闭”的循环。值得注意的是，H+/H2O2双激活协同H+可逆反应设计策略使HN-PBA在正常组织中不发射或减弱信号，最大限度地减少了来自身体的“假阳性”信息，这有利于提高肿瘤诊断的准确性。

图2. HN-PBA（10μM）在pH 6.5下对不同浓度H2O2的吸收光谱，NIR-I和NIR-II荧光光谱

为了研究在酸性环境中使用HN-PBA以高特异性和灵敏度检测H2O2的可行性，首先研究了HN-PBA（10μM）的H2O2依赖性吸收和荧光光谱特征。如图2a-b所示，HN-PBA本身分别在628/675 nm处显示出吸收/发射峰。当H2O2水平升高时，628nm处的吸收逐渐降低，而825nm处的吸收明显增加。此外，HN-PBA暴露于H2O2会导致675 nm处的NIR-I荧光降低（图2b），但在808 nm激发下检测到1060 nm处NIR-II荧光的剂量依赖性增加（图2c）。这种反应归因于H2O2与硼酸酯的反应，该反应导致巯基的形成，从而增强了ICT过程并导致NIR-II荧光发射。此外，1060 nm处的荧光强度与H2O2浓度（50-350μM）呈线性正比，H2O2的检测限计算为1.2μM（图2d）。

HN-PBA在肿瘤区域产生了特定的荧光信号，表明内源性H2O2和酸性肿瘤环境成功地积累和激活了探针（图3a、b）。值得注意的是，在探针注射（PI）后2小时，肿瘤轮廓清晰可见。随着时间的推移，肿瘤荧光信号逐渐增加，并在24小时PI达到最大值（图3b）。此外，仍然观察到相当大的荧光强度（约90%的峰值）48h注射后，背景干扰可忽略不计，表明HN-PBA为肿瘤干预提供了足够的时间，并在24小时PI时达到27.5±1.5的峰值。在16-32小时的PI期间收集到约25的高T/N比，是ICG的7倍多（图3c）。为了进一步证明“双锁键”探针HN-PBA在区分肿瘤和增强图像对比度方面的优势，与另一种对照探针HN-PBC进行了比较分析，HN-PBC仅被H2O2激活并锁定了第二个“锁”，即对酸性肿瘤基质的惰性。为此，HN-PBA和HN-PBC都被静脉注射到荷瘤小鼠体内，并记录了时间依赖性的体内NIR-II图像。如图3d所示，HN-PBA和HN-PBC负载的小鼠在肿瘤部位随时间逐渐增强成像信号，在注射后24小时达到最大亮度，T/NT比值分别为26.1±1.7和6.5±1.9（图3e）。值得注意的是，与HN-PBC治疗组不同，HN-PBC组随着时间的推移在肝脏和腹部显示非特异性信号激活，HN-PBA负荷组显示出极低的背景信号。实时荧光强度定量显示，注射后24小时，HN-PBA的T/NT比（26.1±1.7）和肿瘤与肝脏比（T/L比（10.7±2.2））比HN-PBC高4.0/4.2倍（图3f-g）。给药后48小时的组织离体分析表明，HN-PBA治疗小鼠的激活信号主要存在于肿瘤中，其他器官的荧光信号可以忽略不计（图3h）。相比之下，注射HN-PBC的小鼠在肿瘤组织和网状内皮系统器官（肝脏和脾脏）中都表现出信号分布（图3i）。此外，组织光强度定量表明，HN-PBA在肿瘤和正常器官之间的对比度高于HN-PBC，这与全身光学成像的结果一致（图3j）。

图4. NIR-II图像引导下手术切除多发性微肿瘤

将不同体积的4T1细胞注射十天后，在白光成像下可见四个不同体积的肿瘤（标记为a、b、c和d）。如图4a所示，注射HN-PBA 2小时后，只有体积较大的肿瘤a发出微弱的荧光信号，而肿瘤b、c和d显示的荧光信号可以忽略不计。这一结果可能因为肿瘤体积与肿瘤H2O2浓度之间存在正相关关系。随着时间的推移，荧光信号在所有肿瘤区域集中分布，但在正常组织中几乎检测不到。肿瘤部位的平均荧光强度与时间的关系图表明，探针的最大积累和激活发生在PI的16-24小时（图4a，b）。最重要的是，上述多发性肿瘤的T/NT信号比在8.2至14.4之间（图4c），超过了T/NT比>5的既定标准。这一发现表明HN-PBA可以有效地区分多发性微肿瘤和邻近的正常组织。随后，在特定的NIR-II成像辅助下，对微小肿瘤（标记为T1-T4）进行了完全导航，并通过病理分析评估了手术结果（图4d-f）。H&E染色显示，切除的肿瘤组织的整个边界与正常组织明显不同，残余负边缘直径约为0.25 mm（图4g）。血管内皮生长因子（VEGF）是一种重要的血管生成因子，在肿瘤微环境中起着至关重要的作用，VEGF的过表达与肿瘤的发生和进展密切相关。与正常组织相比，肿瘤组织中VEGF的阳性信号更高，这为切除部位的癌变提供了额外的证据（图4g）。

首先，在第四个乳腺脂肪垫中使用含有萤火虫荧光素酶基因（4T1-Luc）的4T1细胞构建原发性肿瘤模型，因为生物发光为评估肿瘤模型和确定肿瘤位置提供了内源性标记（图5a，b）。肿瘤植入后10天，以100nM的剂量将HN-PBA全身给药到小鼠体内。通过NIR-II成像和生物发光监测HN-PBA在肿瘤部位的特异性激活。如图5c所示，静脉注射探针4小时后，在小鼠的肿瘤和腹部都检测到微弱的荧光信号。随着时间的推移，注射后肿瘤部位的明亮和特异性荧光信号显著增强，注射后12小时，原发性肿瘤的边界清晰可见，背景干扰微弱，表明内源性H2O2/酸性TEM成功激活了探针（图5c）。注射后24小时，肿瘤显示出最大的荧光强度，T/NT比值高达17.0±2.6，能够在图像引导下切除肿瘤（图5d）。随后，使用高特异性NIR-II成像检查原发性肿瘤。值得注意的是，切除肿瘤的生物发光信号与NIR-II成像一致，表明HN-PBA在精确定位原发肿瘤方面具有很高的可靠性（图5e，f）。为了评估HN-PBA的生物分布，在探针注射后24小时解剖小鼠，并对主要器官和肿瘤进行离体NIR-II和生物发光成像。由于HN-PBA被过表达的H2O2/酸性TEM特异性激活，肿瘤中的荧光信号明显比其他器官中的信号亮（图5g，h）。为了验证HN-PBA检测转移性病变的潜力，研究者对术后小鼠和同一批原发性肿瘤小鼠在额外饲养20天后进行了体内和体外荧光成像研究。在将HN-PBA静脉注射到术后和原发性肿瘤小鼠体内后，捕获了时间依赖性荧光图像（图5i）。与手术后小鼠中可忽略的荧光信号不同，在原代小鼠中观察到明显更高的肿瘤信号，肿瘤边界清晰（图5i）。此外，相关的定量荧光强度表明，注射后24小时的最高T/NT比为24.3±3.1，比原发性肿瘤植入10天高1.5倍（图5j）。有趣的是，首次在胸腔内观察到微弱的NIR-II荧光信号（图5i，插图）。研究者推测肿瘤转移可能发生在肺部，产生与肿瘤相关的H2O2，并触发探针HN-PBA的荧光反应。为了验证这一假设，对主要器官进行了生物发光成像、离体图像和H&E染色测试。如图5k所示，原发肿瘤区域和胸腔的生物发光信号与体内荧光成像一致（图5i，k），表明确实发生了转移性病变。同时，离体NIR-II成像显示，肺组织和肿瘤的荧光亮度均高于其他器官（图5l）。根据相关的定量荧光强度分析，肺转移显示出6.4的高SBR（ROIa/ROId）（图5m，n），而手术后小鼠肺部的SBR约为1，表明图像引导手术切除后没有肿瘤复发。

静脉注射4T1-Luci肿瘤细胞（1X106）10天后，获得生物发光图像以显示肿瘤位置并确认转移模型的有效建立（图6a，b）。HN-PBA给药24小时后，解剖小鼠，离体肺图像显示明显的NIR-II荧光信号（图6c），而ICG组观察到的荧光信号可以忽略不计（图6d）。荧光强度的定量表明，HN-PBA注射组肺结节与正常区域的信号比比ICG治疗组高2.8倍（SBR计算为5.8比2.1），验证了HN-PBA在准确描绘小转移边界方面的可靠性（图6e）。随后，利用高分辨率NIR-II成像技术和HN-PBA的高对比度肿瘤成像能力，进行了离体手术切除（图6f）。微小的肺转移部位（直径小至约0.7毫米）很容易被切除（图6g）。进行H&E染色以确认转移瘤的精确切除。Ki67染色结果还显示，切除的肺组织中的肿瘤增殖明显高于正常组织，进一步表明肺中存在转移（图6h，i）。这些实验表明，HN-PBA可以在高特异性NIR-II成像指导下识别和去除肺转移区域，突出了研究者提出的“双锁钥匙”探针的潜在临床应用。

图7. NIR-II图像引导癌症临床标本应用

为了进一步验证HN-PBA在精确识别肿瘤组织和划定肿瘤边界方面的临床能力，从患者中获得新鲜切除的癌症组织，并在原位喷洒HN-PBA后使用NIR-II光学系统成像。如图7a、b所示，HN-PBA给药10分钟后可以识别肿瘤边缘，表明探针穿透了肿瘤实质，并被内源性H2O2/酸性环境有效激活。切除的肿瘤组织的信号强度随时间逐渐增加，并在60分钟内达到最大值（图7b-c）。重要的是，肿瘤中区域a的荧光亮度是区域c的8.1倍，使其适用于图像引导手术和其他应用（图7c–d）。因此，在高特异性NIR-II荧光成像的指导下，去除肿瘤边界（图7b中的黑色循环）并通过病理染色进行检查。H&E染色结果表明，通过可见光检查难以区分的肿瘤区域及其边界可以通过尾部“双键和键”探针HN-PBA进行区分（图7b-E）。

总之，成功开发了一种双病理参数协同激活的NIR-II荧光探针HN-PBA，用于原位和转移性乳腺癌症的精确肿瘤描绘和图像引导切除。通过利用肿瘤微环境中固有的弱酸和过表达的H2O2水平，HN-PBA在1060 nm处表现出增强的NIR-II荧光信号，特别是对TME内H2O2/酸度的共同激活的响应。该探针的“双锁和钥匙”设计最大限度地减少了非特异性激活和潜在的假阳性，导致T/N比“始终开启”探针ICG和单一生物标志物（H2O2）激活探针HN-PBC高8.2/4.0倍。皮下多发性微肿瘤模型的病理数据表明，HN-PBA可以精确地识别和切除直径低至约0.25mm的手术阴性边缘的肿瘤。得益于HN-PBA的高分辨率和高特异性NIR-II荧光成像，原位和转移性乳腺病变与周围的正常组织可以清楚地区分，在NIR-II荧光成像的指导下，直径约0.7mm的微小肺转移灶可以很容易地切除。有趣的是，在临床癌症标本中，探针有效地描绘了视觉上难以区分的病变和边界。这种多刺激协同激活策略将促进可靠的荧光诊断剂的开发，用于临床术前肿瘤诊断和术中导航。

参考文献

Dou K, Lu J, Xing Y, et al. Metabolic Acidity/H2O2 Dual‐Cascade‐Activatable Molecular Imaging Platform Toward Metastatic Breast Tumor Malignancy[J]. Angewandte Chemie, 2024: e202419191.

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