本文要点：本研究通过创新设计合成具有新型骨架Cy15s的NIR-II荧光团，成功将吲哚菁聚甲炔的发射波长红移至1200 nm以上，显著提升了生物成像的对比度和穿透深度。开发了简单且模块化的四步合成路线，为临床成像剂的优化提供了重要参考。Cy15s在二氯乙烷（DCM）中表现出最高1287 nm的发射波长和117.1 M−1cm−1的亮度，是现有1200 nm以上发射聚甲炔荧光团亮度的6倍。低细胞毒性和优异光学特性使其能够实现高信噪比的NIR-IIb血管成像和长期原位肿瘤成像。

本研究提出了一种新的合成策略，涉及稳定的中间体和整体的4步合成路线，以构建Cy15 荧光团。如方案 1B 所示，通过 Vilsmeier-Haack 反应，戊二烯衍生物可以轻松高效地从环酮合成。通过将戊二烯醛与苯并吲哚衍生物缩合，获得了氯取代醛。通过可选的Suzuki 偶联反应，获得了单官能醛2。然后，以酮为连接单元，通过高效的羟醛缩合定量合成具有15碳链的化合物3。最后，通过简单的金属有机反应，例如 Grignard 反应，高效合成了吸收峰超过1,200 nm、发射峰超过1,250 nm的Cy15荧光团。

方案1. 吲哚菁聚甲炔荧光团的合成工艺

1上的初始氯化物可以很容易地被取代（R1）改变聚甲辛链的电子和空间特性。通过使用各种有机金属试剂，不同的烷基或芳基（R2）可以连接到共轭链的中心。此外，聚甲辛主链上的环（表示为环 A 和 B）可以定制以控制Cy15的构象，从而影响弯曲角度和扭转角度等参数。通过这些方法，研究者成功合成了10个具有不同取代基和构象的Cy15荧光团，命名为SJ系列（SJ-1174、SJ-1246、SJ-1249、SJ-1260、SJ-1268、SJ-1269、SJ-1271、SJ-1275、SJ-1277 和 SJ- 1287）。图 2A、2B显示了 Cy15 在 DCM 中的归一化吸收和发射光谱。Cy15s 在 NIR-II 区域表现出很强的吸收能力，具有高达 2.5 × 105M−1·cm−1 的高摩尔吸收系数 （ε）和0.048%荧光量子产率 （ΦF），优于发射波长超过 1,200 nm 的其他聚甲辛。Cy15s 的斯托克斯位移 （54-63 nm） 大约是 Cy7-Cy11 系列 （28-37 nm） 的两倍，也高于其他 NIR-II 聚甲嘧啶的斯托克斯位移。

图2. Cy15s 的化学结构和光谱

简而言之，共轭链上的吸电子取代导致波长红移，而电子供体修饰导致Cy15 的蓝移和量子产率增加。掺入更多的 5 元环导致波长显著增加，而量子产率则合理降低。增强的空间位阻也提高了量子产率。Cy15s 的最大吸收波长范围为1128 至 1241 nm，而最大发射波长范围为1174至1287 nm。量子产率（范围从0.010% 到0.048%）和高摩尔消光系数（高达2.6 × 105M−1·cm−1） 有助于实现高达117.1 M−1·cm−1的亮度，比发射波长超过 1,200 nm 的聚甲辛荧光基团的最佳性能高6倍。

图3. Cy15s 胶束的构建和表征

PBS 中 SJ-1249-MICELLES和 SJ-1271-胶束的归一化吸收和发射光谱表明，尽管在水相中吸收展宽，但最大吸收和发射波长与有机相中的波长相似（图3B）。首先评估胶束中 Cy15s 的不同重量分数。由动态光散射 （DLS） 确定的尺寸分布和 zeta 电位 （-12.33 mV） 证实了胶束的成功制备。有趣的是，增加染料负载导致更小的纳米颗粒尺寸。SJ-1271-胶束在 0.25% 染料负载下的平均直径为 ∼112 nm，在 5.0% 染料负载下减小到 ∼48 nm。同样，SJ-1249-MICELLES在 0.5% 染料负载量下显示直径为 ∼90 nm，在 5.0% 染料负载量下显示直径为 ∼56 nm。值得注意的是，SJ-1249-MICELLES（1%）和SJ-1271-胶束（0.5%）的低染料载量表现出最高的荧光强度（图3C）。然而，较高的染料载量导致荧光强度降低，这可能是由于较小胶束中聚集引起的猝灭（ACQ）效应增强。在相同吸光度下，在808 nm 激光激发下，SJ-1249-MICELLES在 PBS 中表现出与ICG相比显着优越的光稳定性（A808= 0.6）。具体来说，SJ-1249-MICELLES保留了其初始强度的80%，而ICG下降到22%（图3D）。当在相同浓度（1.747×10−4mol/L），SJ-1271-胶束和SJ-1249-MICELLES在PBS和生理盐水中均显示出比ICG更好的光稳定性，分别保留了其初始强度的87%和76%，而ICG的强度下降到40%。

在磷酸盐缓冲液（PBS）中，使用相同摩尔浓度、激发激光波长（808 nm）和功率密度（60 mW/cm²），通过不同长通滤波器（LP 1100、LP 1300和LP 1500）对SJ-1271-胶束、SJ-1249-MICELLES和ICG的亮度进行了比较。结果表明，在LP 1300下，SJ-1249-MICELLES和SJ-1271-胶束的亮度分别比ICG高5.1倍和4.1倍；在LP 1500下，它们的亮度分别比ICG高9.6倍和5.1倍（图3E和4F）。SJ-1249-MICELLES在超过1500 nm的波长下展现出更高的亮度，使其成为NIR-IIb成像的有力候选者。

图4. NIR-II血管系统体内成像

接下来，对小鼠进行NIR IIb体内血管成像。使用不同长通滤波器（LP 1100、LP 1300和LP 1500）对后肢血管进行成像比较，结果显示，使用LP 1500成像相比LP 1100和LP 1300实现了更高的信噪比（SNR）和更低的半高全宽（FWHM）值（图4A和S19）。在LP 1500下，黄点虚线处编号为1、2和3的三条血管清晰可辨，其最大信噪比分别为3.79、2.86和5.99，半高全宽分别为351微米、209微米和895微米（血管1-3）。相比之下，中间的血管（血管2）在LP 1100和LP 1300下几乎难以分辨。LP 1500下优异的信噪比和半高全宽可归因于NIR-IIb波段组织散射的减少。

为了进一步比较SJ-1249-MICELLES和ICG在后肢成像中的效果，研究者进行了详细的对比实验。结果显示，使用SJ-1249-MICELLES时，股动脉和股静脉清晰可辨，其最大信噪比（SNR）分别为5.80和5.07，半高全宽（FWHM）分别为387微米和532微米（图4C，血管1和2）。相比之下，ICG成像仅显示一个峰值，信噪比为1.51，半高全宽为508微米（图4B，血管1）。此外，SJ-1249-MICELLES还能识别出五条毛细血管，其最大信噪比分别为6.79、5.00、4.33、5.96和4.33（图4C，血管3-7）。而使用ICG成像只能识别出四条毛细血管，且信噪比较低，分别为1.37、1.40、1.57和1.52（图4B，血管2-5）。在腹部的NIR-IIb成像中，可以识别出三条毛细血管，其最大信噪比分别为2.90、2.67和3.39，半高全宽分别为196微米、472微米和385微米（图4D，血管1-3）。脑血管成像显示，中央血管的最大信噪比为5.37（血管2），并识别出三条毛细血管，其最大信噪比分别为3.87（血管1）、2.12（血管3）和1.82（血管4）（图4E）。这些高信噪比的血管成像结果突显了新型吲哚氰多甲基荧光染料Cy15s在NIR-IIb成像中的巨大潜力。

图5. 原位4T1荷瘤小鼠的NIR-II成像

通过将 4T1 细胞植入 Balb/c 裸鼠的乳腺脂肪垫中建立了原位乳腺肿瘤模型。随后，通过尾静脉注射将SJ-1249-Micelles 注入荷瘤小鼠体内，并进行时间依赖性的近红外二区（NIR-II）成像（图5A）。增强的渗透性和滞留（EPR）效应使得肿瘤与正常组织之间的差异更加明显，这是因为肿瘤中微球的滞留量更大，导致荧光强度更高。值得注意的是，在注射后观察到肿瘤有强烈的荧光，即使在注射后72小时也能检测到肿瘤周围的血管。测量了肿瘤与正常组织的比率（TNR）以及正常组织随时间变化的荧光强度（图5B）。SJ-1249-Micelles 的荧光信号每24小时下降到原来的75%，半衰期为2.4天，而TNR在注射后 6 小时达到峰值，高达3.0，并在72小时后保持在1.9。SJ-1249-Micelles在肿瘤中的超长灌注时间表明其具有长期监测的能力，这对于进一步的体内应用具有优势。这种延长的滞留时间能够有效追踪肿瘤的动态变化以及对治疗的反应，从而增强对肿瘤进行综合纵向研究的潜力。这些特性使得 SJ-1249-Micelles 成为癌症研究和治疗监测中持续评估的有前途的工具。此外，在注射 SJ-1249-Micelles 后 6 小时进行的NIR-II成像测量了肿瘤的信噪比（SNR），揭示了高达4.76的最大SNR（图5C）。还使用1208 nm激光激发和1500 nm长通滤波器进行了肿瘤及其周围血管的NIR-IIb成像。肿瘤和血管很容易区分，可以识别出肿瘤附近的四条毛细血管，最大SNR达到2.44。SJ-1249-Micelles 在肿瘤和毛细血管的无创 NIR-II 成像方面显示出巨大的潜力。

本文构建了一种新的吲哚氰多甲烯荧光染料Cy15s支架，其最大吸收波长超过1200 nm，发射波长超过1280 nm，是目前吲哚氰多甲烯类中最长的。开发了一种整体4步的模块化简洁合成路线，用于合成十五甲烯吲哚氰荧光染料Cy15s。新的共轭链允许通过改变弯曲角和旋转角进行多次修饰，从而调节分子结构，使最大发射波长从1174 nm调节到1287 nm，与计算化学研究结果高度一致，并且实现了高达117.1 M−1⋅cm−1的显著亮度。得益于水溶性微球的低细胞毒性和良好的吸收发射光谱，分别获得了小鼠后肢、腹部和大脑的NIR-IIb血管成像，信噪比（SNR）分别为6.79、3.39和5.37。原位4T1肿瘤荷载小鼠的NIR-II成像显示，肿瘤和肿瘤周围毛细血管可以被识别，具有高达3.0的肿瘤与正常组织比（TNR）和4.76的信噪比（SNR）。本研究为共轭链提供了一种新的支架，为NIR-II探针的设计和合成开辟了新途径。这一创新增强了深层组织成像能力和肿瘤研究。本研究的方法和发现可为未来研究提供重要参考，特别是在优化成像剂以用于临床应用以及通过先进的成像技术改善对肿瘤生物学的理解方面。

参考文献

Ge R T, Xiong F, Chen Z B, et al. Indocyanine polymethine fluorophores with extended π-conjugation emitting beyond 1,200 nm for enhanced NIR-II imaging[J]. Chem, 2025.

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