总膳食纤维检测试剂盒使用说明书
2025-03-17 来源:本站 点击次数:352
简介：
膳食纤维是一种复杂的有机物质的混合物，包括亲水性化合物，如可溶和不可溶的多糖和不可消化的低聚糖，以及一系列不健康的或多或少疏水性的化合物，如角质、树莓和木脂素。本手册中概述的总膳食纤维测定程序基于Lee等人的方法。以及Prosky等人。（AOAC 991.43、AOAC 985.29、AACC 32-07.01和AACC 32-05.01）。然而，Megazyme全膳食纤维试剂盒中的酶也可用于其他膳食纤维分析方法，如AACC方法32-21.01和AACC方法32-06.01。12,3
原理（总膳食纤维）：
总膳食纤维（TDF）是在干燥和脱脂（如果脂肪含量大于10%）材料的复样上测定的。样品在~100°C下用热稳定α-淀粉酶煮熟，使淀粉凝胶化、水解和解聚；在60°C下与蛋白酶（溶解和解聚蛋白质）和淀粉葡萄糖苷酶（将淀粉碎片水解成葡萄糖）一起培养；用四体积乙醇沉淀可溶性纤维，去除淀粉中解聚的蛋白质和葡萄糖。过滤残留物；用78%乙醇、95%乙醇和丙酮洗涤；干燥；称重。对一份样品进行蛋白质分析，另一份在525°C下培养以测定灰分。TDF是过滤和干燥残渣的重量减去蛋白质和灰分的重量。
Megazyme-TDF检测试剂盒的主要优点是它含有高纯度、无干扰活性的酶，并且酶的活性是标准化的。标准化α-淀粉酶活性在抗性淀粉测定中的重要性已得到公认。Megazyme淀粉葡萄糖苷酶基本上不含纤维素酶，而其他常用制剂含有严重的这种活性污染，导致β-葡聚糖的溶解和低估。所有的Megazyme TDF酶都以即用、稳定的液态形式供应。
范围：
适用于谷类、果蔬、谷类水果制品及食品。
酶纯度和标准化：
采用AOAC方法985.29和991.43和AACC方法32-05.01中推荐的标准，评估了巨酶α-淀粉酶、蛋白酶和淀粉葡萄糖苷酶的有效性和纯度。Megazyme耐热α-淀粉酶（E-BLAAM）的活性为3000 U/mL（Ceralpha法）；蛋白酶的供应浓度为50 mg/mL（~350酪氨酸U/mL）；淀粉葡萄糖苷酶的供应浓度为200 U/mL（对硝基苯基β-麦芽糖苷甙底物）（或可溶性淀粉3300 U/mL）。这种淀粉葡萄糖苷酶活性是传统TDF分析中所用浓度的150%，因此在分析中使用0.2毫升（而不是0.3毫升）。
Megazyme淀粉葡萄糖苷酶（E-AMGDF）基本上不含纤维素酶，而在用于TDF测定的其他制剂中，纤维素酶污染可高达淀粉葡萄糖苷酶的1%（以活性计）。这种程度的污染导致β-葡聚糖的低估率高达10-15%。
巨酵素酶的测量和标准化方法可根据要求提供。
TDF检测试剂盒：
Megazyme提供100/200分析试剂盒，其中包含完整的分析方法以及：
100测定试剂盒（cat。不。K-TDFR-100A）
200测定试剂盒（cat。不。K-TDFR-200A）
瓶子3：（x 2）纯化淀粉葡萄糖苷酶（20毫升，可溶性淀粉3300 U/mL）（Megazyme cat。编号：E-AMGDF）。
分析级硅藻土，100 g或500 g包装，可单独购买（类别。编号G-CEL-100G或cat。编号G-CEL-500G）。®
TDF检测对照试剂盒（）：K-TDFC公司
该试剂盒与TDF分析试剂盒一起使用，以确定酶的有效性和纯度。该试剂盒包含下列每种成分的一小瓶和一份技术数据表（K-TDFC；膳食纤维对照品）。
该试剂盒中包含的每种成分的量足以进行至少10次分析。
方法1：
总、可溶性和不溶性膳食纤维的测定
根据AOAC方法991.43“总、可溶和不溶
《食品中的膳食纤维》（1991年第一次行动）和AACC法
32-07.01“食品和食品中可溶性、不溶性和总膳食纤维的测定”（最终批准10-16-91）。
定义：
本方法是对AACC总膳食纤维（TDF）法（32-05.01）和AACC可溶性/不溶性膳食纤维法（燕麦制品）32-21.01（见第9页注1）的简化修改
1. 简单地说，1g干燥食品样品（复制品）通过热稳定α-淀粉酶、蛋白酶和淀粉葡萄糖苷酶进行连续酶消化。
2. 过滤不溶性膳食纤维（IDF），然后用温蒸馏水洗涤残留物。用4体积95%乙醇（EtOH）沉淀滤液和水洗液的混合液，测定可溶性膳食纤维（SDF）。然后过滤沉淀物并干燥。SDF和IDF残基均针对蛋白质、灰分和空白进行校正，以便最终计算SDF和IDF值。
3. 用EtOH沉淀SDF，然后过滤、干燥和称重残留物。总膳食纤维（TDF）值根据蛋白质和灰分含量进行校正。
经美国谷物化学家协会许可再版，美国明尼苏达州圣保罗市。
范围：
本方法测定加工食品和原材料（如谷类产品、水果和蔬菜）中的可溶性、不溶性和总膳食纤维含量。
仪器：
1. 400 mL和600 mL高的烧杯。
2. 熔块坩埚，Gooch，熔块盘，Pyrex50 mL，孔径粗，ASTM 40-60µm，康宁诺。32940-50C或同等产品。准备如下：®®
a、 在525°C下在马弗炉中过夜。
b、 用真空除去硅藻土和灰烬材料。
c、 室温下，在2%微量清洁溶液（试剂7，第5页）中浸泡1h。
d、 用水和去离子水冲洗坩埚。
e、 对于最终冲洗，使用15 mL丙酮并风干。
f、 向干燥坩埚中添加约1.0 g硅藻土，并在130°C下干燥至恒重。
g、 在干燥器中冷却坩埚约1小时，并记录含有硅藻土的坩埚的重量。
3. 过滤瓶，厚壁，带1L侧臂。
4. 过滤瓶用橡胶环适配器。
5. 真空源：真空泵或抽气器，带有可调节真空的调节器。
6. 大容量（20-24升）带盖水浴槽；能够保持100°C的温度；配有自动定时器，用于开关操作。
7. 天平，0.1mg精度。
8. 两个机械对流烘箱，设置为103±2°C和130±3°C。
9. 定时器。
10. 带SiO或同等干燥剂的密闭干燥器。干燥剂每两周在130°C烘箱中干燥一夜。2
11. pH计。
12. 容量为50μL和5μL的移液管。
13. 分配器
a、 对于78%EtOH、95%EtOH和丙酮，15±0.5 mL。
b、 缓冲液40±0.5 mL。
14. 量筒，500毫升。
15. 磁力搅拌器和搅拌棒。
16. 橡胶抹刀。
17. 马弗炉，525±5°C。
试剂：
1. 乙醇，95%v/v。
2. 乙醇，78%。将821 mL 95%v/v乙醇放入1 L容量瓶中。用去离子水稀释至一定体积。混合均匀。检查液位，如有必要，添加更多去离子水，使其恢复至1L标记。
3. 丙酮，试剂级。
4. TDF分析用酶（巨酵素）。储存在0-5°C。
a、 α-淀粉酶，热稳定（E-BLAAM）；3000 Ceralpha单位/mL。
b、 蛋白酶（E-BSPRT）；50毫克/毫升；350个酪氨酸单位/毫升。
c、 淀粉葡萄糖苷酶（E-AMGDF）；200 pNPβ-麦芽糖苷单位/mL（或可溶性淀粉3300单位/mL）。
5. 去离子水。
6. Celite，分析级（Megazyme cat。编号G-CELI）。®TE公司
7. 清洁溶液，Micro（国际产品公司，新泽西州特伦顿）。用去离子水配制2%溶液。
8. MES/TRIS缓冲液，每个0.05 M，24°C时pH值8.2。溶解
19.52 g 2（N-吗啉基）乙磺酸（MES）（Megazyme cat。编号B-MES250）和12.2 g三羟甲基氨基甲烷（tris）（Megazyme cat。1.7升去离子水。用6.0 N NaOH将pH调至8.2。用水稀释至2升。重要的是将缓冲液的pH值在20°C时调整到约8.3，或在27-28°C时调节到大约8.1。
9. 盐酸溶液，0.561 N。将93.5 mL 6 N HCl加入1 L容量瓶中约700 mL水中。用水稀释至1升。
10. pH标准。pH值为4.0、7.0和10.0的缓冲溶液。
酶纯度：
为了确保有适当的酶活性和没有不良的酶活性，在整个程序中运行下列材料。每一批新的酶都要检测，之前6个月没有检测过的酶也要检测。
或者，酶活性和纯度可以通过本手册第17页和第18页总结的分析程序来确定。
一 该活动不应出现在测试中。该活动应在测试中完全发挥作用。由于柑橘果胶的不完全沉淀，其值较低。bc
d这种材料含有高水平的“抗酶”淀粉。准确的预期回收值将受到试验中使用的耐热α-淀粉酶水平的影响。
程序：
1空白
每次分析时，将两个空白与样品一起放在一起，以测量试剂对残留物的贡献。
2样品
a、 准确称取复制的1.000±0.005 g样品于400 mL高型烧杯中。
b、 向每个烧杯中添加40毫升MES-TRIS混合缓冲溶液（pH值8.2）。在每个烧杯中加入磁力搅拌棒。在磁力搅拌器上搅拌，直到样品完全分散在溶液中（这可以防止块状物的形成，这会使样品无法被酶吸收）。
三。热稳定淀粉酶孵育α
a、 加入50µL热稳定α-淀粉酶溶液，同时低速搅拌。
b、 在每个烧杯上盖上铝箔方块。
c、 将盖好的样品置于98-100°c的振荡水浴中，持续搅拌培养30分钟。一旦所有烧杯都在热水浴中，开始计时。
4很酷
a、 从热水浴中取出所有样品烧杯并冷却至60°C。
b、 拆下箔盖。
c、 如有必要，用抹刀刮掉烧杯周围的任何环和烧杯底部的凝胶。
d、 用移液管用10毫升蒸馏水冲洗烧杯和抹刀的侧壁。
e、 将热水从浴槽中排出60°C的热水。
5蛋白酶孵育
a、 向每个样品中添加100µL蛋白酶溶液。
b、 重新盖上铝箔。
c、 在60±1°c的振荡水浴中孵育，持续搅拌30分钟，水浴温度达到60°c时开始计时。
6pH值检查
a、 从振荡水浴中取出样品烧杯。
b、 拆下盖子。
c、 搅拌时，向样品中加入5ml 0.561N HCl溶液。
d、 检查pH值，应为4.1-4.8。如有必要，可使用额外的5%NaOH溶液或5%HCl溶液调整pH值（见第10页注2）。
7淀粉葡萄糖苷酶孵育
a、 在磁力搅拌器上搅拌的同时加入200微升的淀粉葡萄糖苷酶溶液。
b、 更换铝盖。
c、 在60°c的振荡水浴中培养30分钟，并持续搅拌。水浴温度达到60°C时开始计时。
A、 不溶性膳食纤维
8过滤装置
a、 将含有硅藻土的坩埚去皮，精确至0.1 mg。
b、 使用大约3毫升蒸馏水在坩埚中润湿和重新分配硅藻土层。
c、 对坩埚施加抽吸，将硅藻土拉到熔块玻璃上，形成均匀的垫子。
9过滤酶混合物从步骤7通过坩埚进入过滤瓶。
10洗涤残渣用预热到70°C的10毫升蒸馏水两次。在清洗坩埚中的残留物之前，用水冲洗烧杯。保存滤液和水洗液以测定SDF。将溶液转移到预先去皮的600 mL高型烧杯中（对于SDF测定，请参阅第8页SDF程序的第11步）。
11洗涤残渣用10毫升：
a、 95%乙醚
b、 丙酮
12干坩埚在103°C烘箱中过夜。
13冷坩埚在干燥器中放置约1小时。称量含有膳食纤维残留物和硅藻土的坩埚，精确到最近
0.1毫克。减去皮重，即。
干燥坩埚和硅藻土的重量。
14蛋白质和灰分测定。
对每种纤维的一个残留物进行蛋白质分析，并对第二个残留物进行灰分分析。
a、 用凯氏定氮法对残留物进行蛋白质分析。所有情况下使用6.25因子计算蛋白质g。
b、 对于灰分分析，在525°C下将第二个残渣焚烧5小时。在干燥器中冷却并称重，精确至0.1 mg。减去坩埚和硅藻土重量，以确定灰分含量（见第10页注3）。
B、 可溶性膳食纤维
1-10页。遵循IDF方法的步骤1-10。1-10页。遵循IDF方法的步骤1-10。
11称IDF程序步骤10中预去皮烧杯中滤液和水洗液的混合溶液。
12SDF沉淀
a、 添加4份预热至60°C的95%EtOH。使用一部分EtOH从IDF程序中冲洗过滤瓶（步骤10）。或者，将滤液和水洗液的混合溶液的重量调整至80 g，并添加320 mL预热（60°C）95%EtOH。
b、 让沉淀在室温下形成60分钟。
13过滤装置
a、 将含有硅藻土的坩埚去皮，精确至0.1 mg。
b、 在坩埚中用15毫升78%乙醇从洗涤瓶中润湿并重新分配硅藻土层。
c、 对坩埚施加抽吸，将硅藻土拉到熔块玻璃上，形成均匀的垫子。
14过滤
a、 通过坩埚过滤SDF步骤12中沉淀的酶消化物。
b、 使用含78%乙醚的洗涤瓶和橡胶抹刀，将所有剩余颗粒定量转移到坩埚中。
15洗
使用真空，依次用以下两份15毫升的溶液清洗残留物：（见第10页注4）。
a、 78%环氧乙烷
b、 95%乙醚
c、 丙酮
16干坩埚在103°C烘箱中过夜。
17继续IDF方法的步骤13和14。
C、 总膳食纤维
1-7页。遵循步骤1-7。1-7页。遵循步骤1-7。
8用EtOH沉淀膳食纤维。
a、 向每个样品中加入225毫升95%乙醇，预热至60°C。加热后测量体积。乙醇体积与样品体积之比应为4:1。如果95%的EtOH意外过热至65°C，则添加228 mL用于扩大酒精体积调节。
b、 用大铝箔覆盖所有样品。
c、 让沉淀在室温下形成60分钟。
9继续执行SDF程序的步骤13-17。
计算：
膳食纤维(%) =
来自：R=m中的残留物重量1；R=m中的残留物重量2 m=样品重量1；m=样品重量21122 12
A=来自R的灰分重量；p=来自R和12
来自：
BR=空白残留物；BP=来自BR BA的空白蛋白质=BR的空白灰分。12
提示：这些计算可以通过使用Megazyme Mega Calc来简化，可以从Megazyme网站上的产品下载(www.megazyme.com网站).TM公司
注意：
1. 本方法与AACC方法32-05.01和32-21.01的区别如下：
a、 使用40 mL MES-TRIS缓冲液，每个0.05 M，24°C时pH值8.2，而不是50 mL磷酸盐缓冲液，0.08 M，pH 6.0。
MES-TRIS缓冲液的pH值随温度变化。
MES-TRIS缓冲液（即24°C时为8.2）的pH值在
85-90°C和7.4-7.6（55-60°C）。注意，热稳定α-淀粉酶的最适pH值从60°C时的pH 6.0移动到90°C时的pH 7.0。
b、 由于此处使用的酶活性更高，使用的耐热α-淀粉酶的体积已从200µL减少到50µL。
c、 如有必要，刮掉烧杯周围在热稳定α-淀粉酶培养后留下的任何环。在热稳定α-淀粉酶孵育后，用移液管加入10ml水冲洗抹刀和烧杯侧壁。
d、 蛋白酶作用不需要调节pH值，因此培养液中不添加NaOH。
e、 对于淀粉葡萄糖苷酶的作用，添加5 mL 0.561 N HCl溶液。
f、 对于TDF测定，沉淀步骤中添加的95%EtOH的量为225 mL，而不是280 mL。对于SDF/IDF测定，滤液和洗涤液的重量调整为80 g，而不是100 g。因此，在60℃下添加320 mL 95%EtOH。或者，称取滤液和洗涤液的混合液并加入4 vol。95%乙醇。通过此修改，总过滤体积减少到375-400 mL（参见第11页和第12页图1和2）。
2. 由于溶液的pH值在较低温度下会增加，因此在60°C水浴中放置烧杯直到其准备好进行pH值调整。一般情况下，大多数燕麦、大麦、小麦和玉米制品不需要额外的pH调节（用5%的HCl或5%的NaOH）。对于此类已知产品，在向样品中添加5 mL 0.561 N HCl后，可以跳过pH检查程序。建议将空白溶液pH值的常规检查作为灾难性检查。如果空白不在理想的pH值范围内，也应检查样品。
3. 有一些迹象表明，延迟用95%的EtOH和丙酮清洗IDF残留物可能会导致IDF值膨胀。因此，建议在SDF/IDF程序结束时不要冲洗IDF残留物。
4. 在一些样品中，会形成树胶，从而捕获液体。如果出现这种情况，用抹刀将薄膜层弄碎。
参考文献：
1. Lee，S.C.，Prosky，L.和DeVries，J.W.（1992年）。食品中总可溶性和不溶性膳食纤维的测定.酶重量法，MES-TRIS缓冲液：协作研究。J、 助理关闭。肛门。《化学》，75395-416。
2. 普罗斯基，L.，Asp，N.G.，施维泽，T.F.，德弗里斯，J.W.和弗尔达，I.（1988年）。食品和食品中不溶性、可溶性和总膳食纤维的测定：实验室间研究。J、 助理关闭。肛门。《化学》，711017-1023。
3. 普罗斯基，L.，Asp，N.G.，施维泽，T.F.，德弗里斯，J.W.和弗尔达，I.（1992年）。食品和食品中不溶性和可溶性膳食纤维的测定：合作研究。J、 助理关闭。肛门。
化学。, 75, 360-367.
图1。总膳食纤维测定程序的分析方案。
图2.可溶性和不溶性膳食纤维测定程序的分析方案。
方法2：
总膳食纤维的测定
根据AACC方法32-05.01和AOAC方法985.29。
仪器：
1. 分配器
a、 对于95%乙醇，280±2.0 mL。
b、 78%乙醇、95%乙醇和丙酮为10±0.5 mL。
c、 缓冲液为50±0.5 mL。
2. 所有其他设备如本手册第4页所述。
试剂：
1. pH值为6.0.08的磷酸盐缓冲液。将1.400 g无水磷酸二钠（或1.753 g二水合物）和9.68 g一水磷酸二钠（NaHPO）（或10.94 g二水合物）溶解在约700 mL蒸馏水中。用水稀释至1升。用pH计检查pH值。2424
2. 氢氧化钠溶液，0.275 N。使用适当的处理预防措施，将11.00 g ACS级NaOH溶解在约700 mL蒸馏水中，并放入1 L容量瓶中。冷却并用水稀释至一定体积。
3. 0.325N盐酸溶液。在容量瓶中用水将已知滴定度的储备溶液（即325 mL 1.0 N HCl）稀释至1 L。
程序：
样品制备
总膳食纤维应以干燥、低脂或无脂样品为基础进行测定。使样品均匀化，并在70°C真空烘箱中干燥过夜。在干燥器中冷却，重新称重并记录干燥过程中的重量损失。将干燥样品的一部分干燥至0.3-0.5 mm的筛网。如果样品不能加热，则在研磨前冷冻干燥。如果高脂肪含量（>10%）妨碍正确研磨，则在研磨前用石油醚脱脂三次，每次25毫升（每克样品）。分析混合膳食时，在测定总膳食纤维之前，一定要先提取脂肪。记录因脂肪导致的体重减轻。正确测定去除水分和脂肪的最终膳食纤维百分比。将干燥研磨后的样品储存在干燥器中的加盖罐中，直到分析开始。
方法
在整个过程中使用空白样品，以测量从试剂到残留物的任何贡献。
1. 称取两份1g样品，精确至0.1mg，放入400ml高型烧杯中。样品重量的差异应小于
彼此各20毫克。向每个烧杯中添加50毫升磷酸盐缓冲液（pH 6.0），并用pH计检查pH值。如果pH值不等于6.0±0.1，则进行调整。
2. 加入50µL热稳定α-淀粉酶溶液。
3. 在烧杯上盖上铝箔，放入沸水浴中。烧杯必须在98-100°C下培养15分钟。每隔5分钟轻轻摇动。
注：当槽中烧杯的数量使烧杯内容物难以达到98-100°C的内部温度时，应增加培养时间。使用温度计指示
在98-100°C下达到15分钟。在沸水浴中总共30分钟应足够。
4. 室温下冷却溶液。
5. 通过添加10 mL 0.275 N NaOH溶液将pH值调整至7.5±0.1。用pH计检查pH值。
6. 加入100µL蛋白酶溶液。
7. 用铝箔盖住烧杯，在60°C下培养，连续搅拌30分钟。
8. 冷却并添加10 mL 0.325 N HCl溶液，以调节pH至
4.5±0.2。用pH计检查pH值。
9. 加入200µL淀粉葡萄糖苷酶，盖上铝箔，在60°C下连续搅拌培养30分钟。
10. 添加280毫升95%乙醇，预热至60°C（加热前测量体积）。让沉淀在室温下形成
60分钟。
11. 称取含有硅藻土的坩埚，精确至0.1 mg，然后使用洗涤瓶中78%的EtOH气流湿润并分配坩埚中的硅藻土层。
12. 用吸力将硅藻土拉到烧结玻璃上，使其成为均匀的垫子。保持吸力，并将沉淀从酶消化液中定量转移到坩埚中。
13. 用三份20ml的
78%乙醇，两份10毫升95%乙醇和两份
10毫升丙酮。在某些情况下，可能会形成牙龈
过滤过程中，将液体截留在残渣中。如果是这样，用抹刀打破表面薄膜，以提高过滤效果。在整个过滤过程中，小心的间歇抽吸可以避免较长的过滤时间。
14. 在70°C真空烘箱或105°C空气烘箱中干燥含有残留物的坩埚过夜。
15. 在干燥器中冷却并称重，精确至0.1 mg。减去坩埚和硅藻土的重量，以确定残留物的重量。
16. 采用AACC方法46-13，以N×6.25为转换因子，分析一组重复样品中的蛋白质残留。
17. 在525°C下将第二份残留物样品焚烧5 h。在干燥器中冷却并称重至0.1 mg。减去坩埚和硅藻土重量以测定灰分。
图3。总膳食纤维分析方案。
计算：
如果在样品制备步骤中对样品进行脱脂或干燥，则对脂肪和/或水的最终%TDF进行校正。
提示：这些计算可以通过使用Megazyme Mega Calc来简化，可以从Megazyme网站上的产品下载(www.megazyme.com网站). 另请参阅本手册第9页。TM公司
参考文献：
1. 官方分析化学家协会。（1985年）。官方分析方法，第14版，补遗1期。秒。43，A14-43，A20，第399页。
2. 官方分析化学家协会（1986年）。方法的改变。J、 助理关闭。肛门。《化学》，69370。
3. 官方分析化学家协会（1987年）。方法的改变。J、 助理关闭。肛门。化学，70，393。
4. 普罗斯基，L.，Asp，N.G.，弗尔达，I.，德弗里斯，J.W.，施维泽，T.F.和哈兰，B.F.（1985年）。食品和食品中总膳食纤维的测定：合作研究。J、 助理关闭。肛门。化学，68677。
5. 普罗斯基，L.，Asp，N.G.，施维泽，T.F.，德弗里斯，J.W.和弗尔达，I.（1988年）。食品和食品中不溶性、可溶性和总膳食纤维的测定。J、 助理关闭。肛门。《化学》，711017。
活性和纯度的测量
用于总膳食纤维测量的酶
为了成功应用AACC/AOAC国际膳食纤维分析程序，所用的酶必须具有所需的活性，并且没有重要的污染活性。迄今为止遇到的一些问题包括：
a、 纤维素酶、木聚糖酶和果胶酶污染淀粉葡萄糖苷酶（导致β-葡聚糖、阿拉伯木聚糖和果胶降解和低估）。
b、 不同浓度的耐热α-淀粉酶（影响抗性淀粉的测量）（见参考文献1）。
c、 蛋白酶受到1,3:1,4-β-葡聚糖酶的污染（导致对β-葡聚糖的低估）。
所需活动的标准化：
根据AACC/AOAC国际膳食纤维测定中α-淀粉酶、淀粉葡萄糖苷酶和蛋白酶的使用历史，准确可靠测量所需的活性为：
淀粉葡萄糖苷酶（黑曲霉）；每次检测0.2毫升。
3300单位/毫升（用还原糖测定可溶性淀粉）或
200单位/毫升（AMG分析试剂；过量β-葡萄糖苷酶存在下的pNP-β-麦芽糖苷）。
耐热α-淀粉酶（地衣芽孢杆菌）；每次测定0.05毫升。
10000 U/mL（用还原糖测定可溶性淀粉）或3000 U/mL（Ceralpha试剂；在耐热α-葡萄糖苷酶存在下阻断对硝基苯基麦芽庚糖苷）。
蛋白酶（地衣芽孢杆菌；枯草杆菌素A）；每次检测0.10毫升。350酪氨酸单位/mL。（50毫克/毫升；7个酪氨酸单位/毫克）（用酪氨酸标准品测定酪蛋白）。
另外，蛋白酶可以方便地用偶氮酪蛋白（Megazyme cat）进行检测。编号S-AZCAS）。
更多详情：
McCleary，B.V.（1999年）。纤维酶纯度和活性测定。谷物食品世界，44（8），590-596。
重要污染活动：
1在淀粉葡萄糖苷酶制剂中：
对用于膳食纤维测定的淀粉葡萄糖苷酶制剂的评价表明，许多制剂（除了纯度很高、价格昂贵的制剂外）含有大量的污染β-葡聚糖酶（纤维素酶）。在某些制剂中，这种污染高达1%（以活性计），并导致β-葡聚糖的低估高达10-15%。淀粉葡萄糖苷酶中的纤维素酶污染可以通过以大麦β-葡聚糖为底物的粘度学研究或通过使用Megazymeβ-葡聚糖酶测试片（用于β-葡聚糖酶和纤维素酶的测量）来最好地证明和估计。
淀粉葡萄糖苷酶的纤维素酶污染对β-葡聚糖粘度（即分子大小）的影响如图4所示。将大麦β-葡聚糖（10 mL，10 mg/mL）置于醋酸钠缓冲液（50 mM，pH 4.5）中，在40℃下在C型U形管粘度计中与淀粉葡萄糖苷酶（TDF分析中使用的0.2 mL制剂）一起培养。在不同的时间间隔进行粘度测量，比粘度计算为（t-t）/t，其中t是溶剂的流动时间，t是消化液的流动时间。ooo
比较了两种酶制剂：
A。Megazyme淀粉葡萄糖苷酶（E-AMGDF）（与用于TDF测定的其他商业制剂的AMG浓度相同）。
B。另一种市售淀粉葡萄糖苷酶制剂，推荐用于膳食纤维测定。
很明显，Megazyme淀粉葡萄糖苷酶（E-AMGDF）基本上没有污染β-葡聚糖酶，而另一种制剂含有大量的这种污染物。
2在蛋白酶制剂中：
蛋白酶被（1,3）（1,4）-β-葡聚糖酶污染的程度可使用淀粉葡萄糖苷酶中纤维素酶的测量程序进行测定，修改后测定pH值为7.5（磷酸钠缓冲液，50 mM）。
三。在α-淀粉酶制剂中：
耐热α-淀粉酶无污染酶活性。
图4。以大麦β-葡聚糖为底物的粘度计测定淀粉葡萄糖苷酶制剂中的纤维素酶污染（参考正文）。
A、 巨酶淀粉葡萄糖苷酶（E-AMGDF）。
B、 另一种用于膳食纤维测定的淀粉葡萄糖苷酶制剂。
膳食纤维是一种复杂的有机物质的混合物，包括亲水性化合物，如可溶和不可溶的多糖和不可消化的低聚糖，以及一系列不健康的或多或少疏水性的化合物，如角质、树莓和木脂素。本手册中概述的总膳食纤维测定程序基于Lee等人的方法。以及Prosky等人。（AOAC 991.43、AOAC 985.29、AACC 32-07.01和AACC 32-05.01）。然而，Megazyme全膳食纤维试剂盒中的酶也可用于其他膳食纤维分析方法，如AACC方法32-21.01和AACC方法32-06.01。12,3
原理（总膳食纤维）：
总膳食纤维（TDF）是在干燥和脱脂（如果脂肪含量大于10%）材料的复样上测定的。样品在~100°C下用热稳定α-淀粉酶煮熟，使淀粉凝胶化、水解和解聚；在60°C下与蛋白酶（溶解和解聚蛋白质）和淀粉葡萄糖苷酶（将淀粉碎片水解成葡萄糖）一起培养；用四体积乙醇沉淀可溶性纤维，去除淀粉中解聚的蛋白质和葡萄糖。过滤残留物；用78%乙醇、95%乙醇和丙酮洗涤；干燥；称重。对一份样品进行蛋白质分析，另一份在525°C下培养以测定灰分。TDF是过滤和干燥残渣的重量减去蛋白质和灰分的重量。
Megazyme-TDF检测试剂盒的主要优点是它含有高纯度、无干扰活性的酶，并且酶的活性是标准化的。标准化α-淀粉酶活性在抗性淀粉测定中的重要性已得到公认。Megazyme淀粉葡萄糖苷酶基本上不含纤维素酶，而其他常用制剂含有严重的这种活性污染，导致β-葡聚糖的溶解和低估。所有的Megazyme TDF酶都以即用、稳定的液态形式供应。
范围：
适用于谷类、果蔬、谷类水果制品及食品。
酶纯度和标准化：
采用AOAC方法985.29和991.43和AACC方法32-05.01中推荐的标准，评估了巨酶α-淀粉酶、蛋白酶和淀粉葡萄糖苷酶的有效性和纯度。Megazyme耐热α-淀粉酶（E-BLAAM）的活性为3000 U/mL（Ceralpha法）；蛋白酶的供应浓度为50 mg/mL（~350酪氨酸U/mL）；淀粉葡萄糖苷酶的供应浓度为200 U/mL（对硝基苯基β-麦芽糖苷甙底物）（或可溶性淀粉3300 U/mL）。这种淀粉葡萄糖苷酶活性是传统TDF分析中所用浓度的150%，因此在分析中使用0.2毫升（而不是0.3毫升）。
Megazyme淀粉葡萄糖苷酶（E-AMGDF）基本上不含纤维素酶，而在用于TDF测定的其他制剂中，纤维素酶污染可高达淀粉葡萄糖苷酶的1%（以活性计）。这种程度的污染导致β-葡聚糖的低估率高达10-15%。
巨酵素酶的测量和标准化方法可根据要求提供。
TDF检测试剂盒：
Megazyme提供100/200分析试剂盒，其中包含完整的分析方法以及：
100测定试剂盒（cat。不。K-TDFR-100A）
| 瓶子1： | 耐热α-淀粉酶（10毫升，~3000 U/mL |
| （Ceralpha法）；~10000 U/mL（可溶性） | |
| 淀粉）（Megazyme cat。编号：E-BLAAM）。 | |
| 瓶子2： | 纯化蛋白酶（10毫升，50毫克/毫升；约350酪氨酸 |
| U/mL）（Megazyme cat。编号E-BSPRT）。 | |
| 瓶子3： | 纯化淀粉葡萄糖苷酶（20ml，3300u/mL |
| 可溶性淀粉）（Megazyme cat。编号：E-AMGDF）。 |
| 瓶子1： | 耐热α-淀粉酶（20ml，~3000u/mL |
| （Ceralpha法）；~10000 U/mL（可溶性） | |
| 淀粉）（Megazyme cat。编号：E-BLAAM）。 | |
| 瓶子2： | 纯化蛋白酶（20毫升，50毫克/毫升；约350酪氨酸 |
| U/mL）（Megazyme cat。编号E-BSPRT）。 |
瓶子3：（x 2）纯化淀粉葡萄糖苷酶（20毫升，可溶性淀粉3300 U/mL）（Megazyme cat。编号：E-AMGDF）。
分析级硅藻土，100 g或500 g包装，可单独购买（类别。编号G-CEL-100G或cat。编号G-CEL-500G）。®
TDF检测对照试剂盒（）：K-TDFC公司
该试剂盒与TDF分析试剂盒一起使用，以确定酶的有效性和纯度。该试剂盒包含下列每种成分的一小瓶和一份技术数据表（K-TDFC；膳食纤维对照品）。
该试剂盒中包含的每种成分的量足以进行至少10次分析。
| 组件 | 数量 |
| β-葡聚糖（大麦） | 1克 |
| 高直链淀粉 | 10克 |
| 淀粉（小麦） | 10克 |
| 酪蛋白 | 5克 |
| 果胶 | 1克 |
| 落叶松半乳糖 | 1克 |
方法1：
总、可溶性和不溶性膳食纤维的测定
根据AOAC方法991.43“总、可溶和不溶
《食品中的膳食纤维》（1991年第一次行动）和AACC法
32-07.01“食品和食品中可溶性、不溶性和总膳食纤维的测定”（最终批准10-16-91）。
定义：
本方法是对AACC总膳食纤维（TDF）法（32-05.01）和AACC可溶性/不溶性膳食纤维法（燕麦制品）32-21.01（见第9页注1）的简化修改
1. 简单地说，1g干燥食品样品（复制品）通过热稳定α-淀粉酶、蛋白酶和淀粉葡萄糖苷酶进行连续酶消化。
2. 过滤不溶性膳食纤维（IDF），然后用温蒸馏水洗涤残留物。用4体积95%乙醇（EtOH）沉淀滤液和水洗液的混合液，测定可溶性膳食纤维（SDF）。然后过滤沉淀物并干燥。SDF和IDF残基均针对蛋白质、灰分和空白进行校正，以便最终计算SDF和IDF值。
3. 用EtOH沉淀SDF，然后过滤、干燥和称重残留物。总膳食纤维（TDF）值根据蛋白质和灰分含量进行校正。
经美国谷物化学家协会许可再版，美国明尼苏达州圣保罗市。
范围：
本方法测定加工食品和原材料（如谷类产品、水果和蔬菜）中的可溶性、不溶性和总膳食纤维含量。
仪器：
1. 400 mL和600 mL高的烧杯。
2. 熔块坩埚，Gooch，熔块盘，Pyrex50 mL，孔径粗，ASTM 40-60µm，康宁诺。32940-50C或同等产品。准备如下：®®
a、 在525°C下在马弗炉中过夜。
b、 用真空除去硅藻土和灰烬材料。
c、 室温下，在2%微量清洁溶液（试剂7，第5页）中浸泡1h。
d、 用水和去离子水冲洗坩埚。
e、 对于最终冲洗，使用15 mL丙酮并风干。
f、 向干燥坩埚中添加约1.0 g硅藻土，并在130°C下干燥至恒重。
g、 在干燥器中冷却坩埚约1小时，并记录含有硅藻土的坩埚的重量。
3. 过滤瓶，厚壁，带1L侧臂。
4. 过滤瓶用橡胶环适配器。
5. 真空源：真空泵或抽气器，带有可调节真空的调节器。
6. 大容量（20-24升）带盖水浴槽；能够保持100°C的温度；配有自动定时器，用于开关操作。
7. 天平，0.1mg精度。
8. 两个机械对流烘箱，设置为103±2°C和130±3°C。
9. 定时器。
10. 带SiO或同等干燥剂的密闭干燥器。干燥剂每两周在130°C烘箱中干燥一夜。2
11. pH计。
12. 容量为50μL和5μL的移液管。
13. 分配器
a、 对于78%EtOH、95%EtOH和丙酮，15±0.5 mL。
b、 缓冲液40±0.5 mL。
14. 量筒，500毫升。
15. 磁力搅拌器和搅拌棒。
16. 橡胶抹刀。
17. 马弗炉，525±5°C。
试剂：
1. 乙醇，95%v/v。
2. 乙醇，78%。将821 mL 95%v/v乙醇放入1 L容量瓶中。用去离子水稀释至一定体积。混合均匀。检查液位，如有必要，添加更多去离子水，使其恢复至1L标记。
3. 丙酮，试剂级。
4. TDF分析用酶（巨酵素）。储存在0-5°C。
a、 α-淀粉酶，热稳定（E-BLAAM）；3000 Ceralpha单位/mL。
b、 蛋白酶（E-BSPRT）；50毫克/毫升；350个酪氨酸单位/毫升。
c、 淀粉葡萄糖苷酶（E-AMGDF）；200 pNPβ-麦芽糖苷单位/mL（或可溶性淀粉3300单位/mL）。
5. 去离子水。
6. Celite，分析级（Megazyme cat。编号G-CELI）。®TE公司
7. 清洁溶液，Micro（国际产品公司，新泽西州特伦顿）。用去离子水配制2%溶液。
8. MES/TRIS缓冲液，每个0.05 M，24°C时pH值8.2。溶解
19.52 g 2（N-吗啉基）乙磺酸（MES）（Megazyme cat。编号B-MES250）和12.2 g三羟甲基氨基甲烷（tris）（Megazyme cat。1.7升去离子水。用6.0 N NaOH将pH调至8.2。用水稀释至2升。重要的是将缓冲液的pH值在20°C时调整到约8.3，或在27-28°C时调节到大约8.1。
9. 盐酸溶液，0.561 N。将93.5 mL 6 N HCl加入1 L容量瓶中约700 mL水中。用水稀释至1升。
10. pH标准。pH值为4.0、7.0和10.0的缓冲溶液。
酶纯度：
为了确保有适当的酶活性和没有不良的酶活性，在整个程序中运行下列材料。每一批新的酶都要检测，之前6个月没有检测过的酶也要检测。
或者，酶活性和纯度可以通过本手册第17页和第18页总结的分析程序来确定。
| |
活动 | 样品重量 | 预期 |
| 试验样品 | 测试 | （克） | 回收率（%） |
| 柑橘果胶 | 果胶酶一 | 0.1 | 90-95c |
| β-葡聚糖（大麦） |
β-葡聚糖酶 （纤维素酶）一 |
0.1 | 95-100 |
| 小麦淀粉 | 淀粉酶b | 1.0 | 0-1 |
| 酪蛋白 | 蛋白酶b | 0.3 | 0-2 |
| 高直链淀粉 | 淀粉酶 | 1.0 | ~30个d |
一 该活动不应出现在测试中。该活动应在测试中完全发挥作用。由于柑橘果胶的不完全沉淀，其值较低。bc
d这种材料含有高水平的“抗酶”淀粉。准确的预期回收值将受到试验中使用的耐热α-淀粉酶水平的影响。
程序：
1空白
每次分析时，将两个空白与样品一起放在一起，以测量试剂对残留物的贡献。
2样品
a、 准确称取复制的1.000±0.005 g样品于400 mL高型烧杯中。
b、 向每个烧杯中添加40毫升MES-TRIS混合缓冲溶液（pH值8.2）。在每个烧杯中加入磁力搅拌棒。在磁力搅拌器上搅拌，直到样品完全分散在溶液中（这可以防止块状物的形成，这会使样品无法被酶吸收）。
三。热稳定淀粉酶孵育α
a、 加入50µL热稳定α-淀粉酶溶液，同时低速搅拌。
b、 在每个烧杯上盖上铝箔方块。
c、 将盖好的样品置于98-100°c的振荡水浴中，持续搅拌培养30分钟。一旦所有烧杯都在热水浴中，开始计时。
4很酷
a、 从热水浴中取出所有样品烧杯并冷却至60°C。
b、 拆下箔盖。
c、 如有必要，用抹刀刮掉烧杯周围的任何环和烧杯底部的凝胶。
d、 用移液管用10毫升蒸馏水冲洗烧杯和抹刀的侧壁。
e、 将热水从浴槽中排出60°C的热水。
5蛋白酶孵育
a、 向每个样品中添加100µL蛋白酶溶液。
b、 重新盖上铝箔。
c、 在60±1°c的振荡水浴中孵育，持续搅拌30分钟，水浴温度达到60°c时开始计时。
6pH值检查
a、 从振荡水浴中取出样品烧杯。
b、 拆下盖子。
c、 搅拌时，向样品中加入5ml 0.561N HCl溶液。
d、 检查pH值，应为4.1-4.8。如有必要，可使用额外的5%NaOH溶液或5%HCl溶液调整pH值（见第10页注2）。
7淀粉葡萄糖苷酶孵育
a、 在磁力搅拌器上搅拌的同时加入200微升的淀粉葡萄糖苷酶溶液。
b、 更换铝盖。
c、 在60°c的振荡水浴中培养30分钟，并持续搅拌。水浴温度达到60°C时开始计时。
A、 不溶性膳食纤维
8过滤装置
a、 将含有硅藻土的坩埚去皮，精确至0.1 mg。
b、 使用大约3毫升蒸馏水在坩埚中润湿和重新分配硅藻土层。
c、 对坩埚施加抽吸，将硅藻土拉到熔块玻璃上，形成均匀的垫子。
9过滤酶混合物从步骤7通过坩埚进入过滤瓶。
10洗涤残渣用预热到70°C的10毫升蒸馏水两次。在清洗坩埚中的残留物之前，用水冲洗烧杯。保存滤液和水洗液以测定SDF。将溶液转移到预先去皮的600 mL高型烧杯中（对于SDF测定，请参阅第8页SDF程序的第11步）。
11洗涤残渣用10毫升：
a、 95%乙醚
b、 丙酮
12干坩埚在103°C烘箱中过夜。
13冷坩埚在干燥器中放置约1小时。称量含有膳食纤维残留物和硅藻土的坩埚，精确到最近
0.1毫克。减去皮重，即。
干燥坩埚和硅藻土的重量。
14蛋白质和灰分测定。
对每种纤维的一个残留物进行蛋白质分析，并对第二个残留物进行灰分分析。
a、 用凯氏定氮法对残留物进行蛋白质分析。所有情况下使用6.25因子计算蛋白质g。
b、 对于灰分分析，在525°C下将第二个残渣焚烧5小时。在干燥器中冷却并称重，精确至0.1 mg。减去坩埚和硅藻土重量，以确定灰分含量（见第10页注3）。
B、 可溶性膳食纤维
1-10页。遵循IDF方法的步骤1-10。1-10页。遵循IDF方法的步骤1-10。
11称IDF程序步骤10中预去皮烧杯中滤液和水洗液的混合溶液。
12SDF沉淀
a、 添加4份预热至60°C的95%EtOH。使用一部分EtOH从IDF程序中冲洗过滤瓶（步骤10）。或者，将滤液和水洗液的混合溶液的重量调整至80 g，并添加320 mL预热（60°C）95%EtOH。
b、 让沉淀在室温下形成60分钟。
13过滤装置
a、 将含有硅藻土的坩埚去皮，精确至0.1 mg。
b、 在坩埚中用15毫升78%乙醇从洗涤瓶中润湿并重新分配硅藻土层。
c、 对坩埚施加抽吸，将硅藻土拉到熔块玻璃上，形成均匀的垫子。
14过滤
a、 通过坩埚过滤SDF步骤12中沉淀的酶消化物。
b、 使用含78%乙醚的洗涤瓶和橡胶抹刀，将所有剩余颗粒定量转移到坩埚中。
15洗
使用真空，依次用以下两份15毫升的溶液清洗残留物：（见第10页注4）。
a、 78%环氧乙烷
b、 95%乙醚
c、 丙酮
16干坩埚在103°C烘箱中过夜。
17继续IDF方法的步骤13和14。
C、 总膳食纤维
1-7页。遵循步骤1-7。1-7页。遵循步骤1-7。
8用EtOH沉淀膳食纤维。
a、 向每个样品中加入225毫升95%乙醇，预热至60°C。加热后测量体积。乙醇体积与样品体积之比应为4:1。如果95%的EtOH意外过热至65°C，则添加228 mL用于扩大酒精体积调节。
b、 用大铝箔覆盖所有样品。
c、 让沉淀在室温下形成60分钟。
9继续执行SDF程序的步骤13-17。
计算：
膳食纤维(%) =
来自：R=m中的残留物重量1；R=m中的残留物重量2 m=样品重量1；m=样品重量21122 12
A=来自R的灰分重量；p=来自R和12
来自：
BR=空白残留物；BP=来自BR BA的空白蛋白质=BR的空白灰分。12
提示：这些计算可以通过使用Megazyme Mega Calc来简化，可以从Megazyme网站上的产品下载(www.megazyme.com网站).TM公司
注意：
1. 本方法与AACC方法32-05.01和32-21.01的区别如下：
a、 使用40 mL MES-TRIS缓冲液，每个0.05 M，24°C时pH值8.2，而不是50 mL磷酸盐缓冲液，0.08 M，pH 6.0。
MES-TRIS缓冲液的pH值随温度变化。
MES-TRIS缓冲液（即24°C时为8.2）的pH值在
85-90°C和7.4-7.6（55-60°C）。注意，热稳定α-淀粉酶的最适pH值从60°C时的pH 6.0移动到90°C时的pH 7.0。
b、 由于此处使用的酶活性更高，使用的耐热α-淀粉酶的体积已从200µL减少到50µL。
c、 如有必要，刮掉烧杯周围在热稳定α-淀粉酶培养后留下的任何环。在热稳定α-淀粉酶孵育后，用移液管加入10ml水冲洗抹刀和烧杯侧壁。
d、 蛋白酶作用不需要调节pH值，因此培养液中不添加NaOH。
e、 对于淀粉葡萄糖苷酶的作用，添加5 mL 0.561 N HCl溶液。
f、 对于TDF测定，沉淀步骤中添加的95%EtOH的量为225 mL，而不是280 mL。对于SDF/IDF测定，滤液和洗涤液的重量调整为80 g，而不是100 g。因此，在60℃下添加320 mL 95%EtOH。或者，称取滤液和洗涤液的混合液并加入4 vol。95%乙醇。通过此修改，总过滤体积减少到375-400 mL（参见第11页和第12页图1和2）。
2. 由于溶液的pH值在较低温度下会增加，因此在60°C水浴中放置烧杯直到其准备好进行pH值调整。一般情况下，大多数燕麦、大麦、小麦和玉米制品不需要额外的pH调节（用5%的HCl或5%的NaOH）。对于此类已知产品，在向样品中添加5 mL 0.561 N HCl后，可以跳过pH检查程序。建议将空白溶液pH值的常规检查作为灾难性检查。如果空白不在理想的pH值范围内，也应检查样品。
3. 有一些迹象表明，延迟用95%的EtOH和丙酮清洗IDF残留物可能会导致IDF值膨胀。因此，建议在SDF/IDF程序结束时不要冲洗IDF残留物。
4. 在一些样品中，会形成树胶，从而捕获液体。如果出现这种情况，用抹刀将薄膜层弄碎。
参考文献：
1. Lee，S.C.，Prosky，L.和DeVries，J.W.（1992年）。食品中总可溶性和不溶性膳食纤维的测定.酶重量法，MES-TRIS缓冲液：协作研究。J、 助理关闭。肛门。《化学》，75395-416。
2. 普罗斯基，L.，Asp，N.G.，施维泽，T.F.，德弗里斯，J.W.和弗尔达，I.（1988年）。食品和食品中不溶性、可溶性和总膳食纤维的测定：实验室间研究。J、 助理关闭。肛门。《化学》，711017-1023。
3. 普罗斯基，L.，Asp，N.G.，施维泽，T.F.，德弗里斯，J.W.和弗尔达，I.（1992年）。食品和食品中不溶性和可溶性膳食纤维的测定：合作研究。J、 助理关闭。肛门。
化学。, 75, 360-367.
图1。总膳食纤维测定程序的分析方案。
图2.可溶性和不溶性膳食纤维测定程序的分析方案。
方法2：
总膳食纤维的测定
根据AACC方法32-05.01和AOAC方法985.29。
仪器：
1. 分配器
a、 对于95%乙醇，280±2.0 mL。
b、 78%乙醇、95%乙醇和丙酮为10±0.5 mL。
c、 缓冲液为50±0.5 mL。
2. 所有其他设备如本手册第4页所述。
试剂：
1. pH值为6.0.08的磷酸盐缓冲液。将1.400 g无水磷酸二钠（或1.753 g二水合物）和9.68 g一水磷酸二钠（NaHPO）（或10.94 g二水合物）溶解在约700 mL蒸馏水中。用水稀释至1升。用pH计检查pH值。2424
2. 氢氧化钠溶液，0.275 N。使用适当的处理预防措施，将11.00 g ACS级NaOH溶解在约700 mL蒸馏水中，并放入1 L容量瓶中。冷却并用水稀释至一定体积。
3. 0.325N盐酸溶液。在容量瓶中用水将已知滴定度的储备溶液（即325 mL 1.0 N HCl）稀释至1 L。
程序：
样品制备
总膳食纤维应以干燥、低脂或无脂样品为基础进行测定。使样品均匀化，并在70°C真空烘箱中干燥过夜。在干燥器中冷却，重新称重并记录干燥过程中的重量损失。将干燥样品的一部分干燥至0.3-0.5 mm的筛网。如果样品不能加热，则在研磨前冷冻干燥。如果高脂肪含量（>10%）妨碍正确研磨，则在研磨前用石油醚脱脂三次，每次25毫升（每克样品）。分析混合膳食时，在测定总膳食纤维之前，一定要先提取脂肪。记录因脂肪导致的体重减轻。正确测定去除水分和脂肪的最终膳食纤维百分比。将干燥研磨后的样品储存在干燥器中的加盖罐中，直到分析开始。
方法
在整个过程中使用空白样品，以测量从试剂到残留物的任何贡献。
1. 称取两份1g样品，精确至0.1mg，放入400ml高型烧杯中。样品重量的差异应小于
彼此各20毫克。向每个烧杯中添加50毫升磷酸盐缓冲液（pH 6.0），并用pH计检查pH值。如果pH值不等于6.0±0.1，则进行调整。
2. 加入50µL热稳定α-淀粉酶溶液。
3. 在烧杯上盖上铝箔，放入沸水浴中。烧杯必须在98-100°C下培养15分钟。每隔5分钟轻轻摇动。
注：当槽中烧杯的数量使烧杯内容物难以达到98-100°C的内部温度时，应增加培养时间。使用温度计指示
在98-100°C下达到15分钟。在沸水浴中总共30分钟应足够。
4. 室温下冷却溶液。
5. 通过添加10 mL 0.275 N NaOH溶液将pH值调整至7.5±0.1。用pH计检查pH值。
6. 加入100µL蛋白酶溶液。
7. 用铝箔盖住烧杯，在60°C下培养，连续搅拌30分钟。
8. 冷却并添加10 mL 0.325 N HCl溶液，以调节pH至
4.5±0.2。用pH计检查pH值。
9. 加入200µL淀粉葡萄糖苷酶，盖上铝箔，在60°C下连续搅拌培养30分钟。
10. 添加280毫升95%乙醇，预热至60°C（加热前测量体积）。让沉淀在室温下形成
60分钟。
11. 称取含有硅藻土的坩埚，精确至0.1 mg，然后使用洗涤瓶中78%的EtOH气流湿润并分配坩埚中的硅藻土层。
12. 用吸力将硅藻土拉到烧结玻璃上，使其成为均匀的垫子。保持吸力，并将沉淀从酶消化液中定量转移到坩埚中。
13. 用三份20ml的
78%乙醇，两份10毫升95%乙醇和两份
10毫升丙酮。在某些情况下，可能会形成牙龈
过滤过程中，将液体截留在残渣中。如果是这样，用抹刀打破表面薄膜，以提高过滤效果。在整个过滤过程中，小心的间歇抽吸可以避免较长的过滤时间。
14. 在70°C真空烘箱或105°C空气烘箱中干燥含有残留物的坩埚过夜。
15. 在干燥器中冷却并称重，精确至0.1 mg。减去坩埚和硅藻土的重量，以确定残留物的重量。
16. 采用AACC方法46-13，以N×6.25为转换因子，分析一组重复样品中的蛋白质残留。
17. 在525°C下将第二份残留物样品焚烧5 h。在干燥器中冷却并称重至0.1 mg。减去坩埚和硅藻土重量以测定灰分。
图3。总膳食纤维分析方案。
计算：
| 未腐蚀av空白残留物（UABR）= | 影音留白 |
| 空白（从步骤15开始），mg | |
| 空白蛋白残基（BPR）= | 空白中UABR x%蛋白质 |
| （步骤16）/100 | |
| 空白灰渣（BAR）= | UABR x%灰分空白 |
| （步骤17）/100 | |
| 校正空白（CB）= | UABR-BPR-BAR |
| 未腐蚀av样品残留量（USAR）= | Av样品复本残留量 |
| 样品（步骤15）mg | |
| 样品蛋白质残留（SPR）= | 样品中的USAR x%蛋白质 |
| （步骤16）/100 | |
| 样品灰渣（SAR）= | 样品中的USAR x%灰分 |
| （步骤17）/100 | |
| 校正样品残留量（CSR）= | USAR-SPR-SAR-CB |
| %TDF公司= | 100 x CSR/mg样品 |
提示：这些计算可以通过使用Megazyme Mega Calc来简化，可以从Megazyme网站上的产品下载(www.megazyme.com网站). 另请参阅本手册第9页。TM公司
参考文献：
1. 官方分析化学家协会。（1985年）。官方分析方法，第14版，补遗1期。秒。43，A14-43，A20，第399页。
2. 官方分析化学家协会（1986年）。方法的改变。J、 助理关闭。肛门。《化学》，69370。
3. 官方分析化学家协会（1987年）。方法的改变。J、 助理关闭。肛门。化学，70，393。
4. 普罗斯基，L.，Asp，N.G.，弗尔达，I.，德弗里斯，J.W.，施维泽，T.F.和哈兰，B.F.（1985年）。食品和食品中总膳食纤维的测定：合作研究。J、 助理关闭。肛门。化学，68677。
5. 普罗斯基，L.，Asp，N.G.，施维泽，T.F.，德弗里斯，J.W.和弗尔达，I.（1988年）。食品和食品中不溶性、可溶性和总膳食纤维的测定。J、 助理关闭。肛门。《化学》，711017。
活性和纯度的测量
用于总膳食纤维测量的酶
为了成功应用AACC/AOAC国际膳食纤维分析程序，所用的酶必须具有所需的活性，并且没有重要的污染活性。迄今为止遇到的一些问题包括：
a、 纤维素酶、木聚糖酶和果胶酶污染淀粉葡萄糖苷酶（导致β-葡聚糖、阿拉伯木聚糖和果胶降解和低估）。
b、 不同浓度的耐热α-淀粉酶（影响抗性淀粉的测量）（见参考文献1）。
c、 蛋白酶受到1,3:1,4-β-葡聚糖酶的污染（导致对β-葡聚糖的低估）。
所需活动的标准化：
根据AACC/AOAC国际膳食纤维测定中α-淀粉酶、淀粉葡萄糖苷酶和蛋白酶的使用历史，准确可靠测量所需的活性为：
淀粉葡萄糖苷酶（黑曲霉）；每次检测0.2毫升。
3300单位/毫升（用还原糖测定可溶性淀粉）或
200单位/毫升（AMG分析试剂；过量β-葡萄糖苷酶存在下的pNP-β-麦芽糖苷）。
耐热α-淀粉酶（地衣芽孢杆菌）；每次测定0.05毫升。
10000 U/mL（用还原糖测定可溶性淀粉）或3000 U/mL（Ceralpha试剂；在耐热α-葡萄糖苷酶存在下阻断对硝基苯基麦芽庚糖苷）。
蛋白酶（地衣芽孢杆菌；枯草杆菌素A）；每次检测0.10毫升。350酪氨酸单位/mL。（50毫克/毫升；7个酪氨酸单位/毫克）（用酪氨酸标准品测定酪蛋白）。
另外，蛋白酶可以方便地用偶氮酪蛋白（Megazyme cat）进行检测。编号S-AZCAS）。
更多详情：
McCleary，B.V.（1999年）。纤维酶纯度和活性测定。谷物食品世界，44（8），590-596。
重要污染活动：
1在淀粉葡萄糖苷酶制剂中：
对用于膳食纤维测定的淀粉葡萄糖苷酶制剂的评价表明，许多制剂（除了纯度很高、价格昂贵的制剂外）含有大量的污染β-葡聚糖酶（纤维素酶）。在某些制剂中，这种污染高达1%（以活性计），并导致β-葡聚糖的低估高达10-15%。淀粉葡萄糖苷酶中的纤维素酶污染可以通过以大麦β-葡聚糖为底物的粘度学研究或通过使用Megazymeβ-葡聚糖酶测试片（用于β-葡聚糖酶和纤维素酶的测量）来最好地证明和估计。
淀粉葡萄糖苷酶的纤维素酶污染对β-葡聚糖粘度（即分子大小）的影响如图4所示。将大麦β-葡聚糖（10 mL，10 mg/mL）置于醋酸钠缓冲液（50 mM，pH 4.5）中，在40℃下在C型U形管粘度计中与淀粉葡萄糖苷酶（TDF分析中使用的0.2 mL制剂）一起培养。在不同的时间间隔进行粘度测量，比粘度计算为（t-t）/t，其中t是溶剂的流动时间，t是消化液的流动时间。ooo
比较了两种酶制剂：
A。Megazyme淀粉葡萄糖苷酶（E-AMGDF）（与用于TDF测定的其他商业制剂的AMG浓度相同）。
B。另一种市售淀粉葡萄糖苷酶制剂，推荐用于膳食纤维测定。
很明显，Megazyme淀粉葡萄糖苷酶（E-AMGDF）基本上没有污染β-葡聚糖酶，而另一种制剂含有大量的这种污染物。
2在蛋白酶制剂中：
蛋白酶被（1,3）（1,4）-β-葡聚糖酶污染的程度可使用淀粉葡萄糖苷酶中纤维素酶的测量程序进行测定，修改后测定pH值为7.5（磷酸钠缓冲液，50 mM）。
三。在α-淀粉酶制剂中：
耐热α-淀粉酶无污染酶活性。
图4。以大麦β-葡聚糖为底物的粘度计测定淀粉葡萄糖苷酶制剂中的纤维素酶污染（参考正文）。
A、 巨酶淀粉葡萄糖苷酶（E-AMGDF）。
B、 另一种用于膳食纤维测定的淀粉葡萄糖苷酶制剂。
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