抗性淀粉检试剂盒K-RSTAR使用说明书
2025-03-25 来源:本站 点击次数:306
抗性淀粉检测程序（100 次/盒）K-RSTAR
AOAC 方法 2002.02
AACC 方法 32-40.01
CODEX 第二类方法
产品介绍：
根据定义，抗性淀粉（RS）是指不会被人类小肠中的酶水解的淀粉。抗性淀粉会进入大肠，在大肠中微生物的作用下，部分或全部发酵。抗性淀粉通常被视为总膳食纤维（TDF）的组分之一。
1982年，Englyst等人在测定非淀粉多糖时，首次发现了抗酶水解淀粉组分1。Berry2在这项研究的基础上加以扩展，开发了一种抗性淀粉测定程序。该程序结合了Englyst等人1采用的α-淀粉酶/普鲁兰酶处理方法，但省略了将样品加热至100 ℃的初始步骤，使检测条件更接近生理条件。经改进后，测得的样品抗性淀粉含量大幅提高。随后，Englyst等人3-5以健康的回肠造口患者为试验对象证实了这一发现。
到20世纪90年代初，研究人员已充分认识到抗性淀粉的生理功能。欧洲抗性淀粉协会（EURESTA）的研究计划开发了多种新的/改良方法6,7。Champ7方法基于Berry2方法进行改进，可直接测定抗性淀粉。主要改进包括将样品量从10 mg增至100 mg，只使用胰腺α-淀粉酶（而不是与Englyst1和Berry2一样使用胰腺α-淀粉酶加普鲁兰酶）来消化样品，以及在pH 6.9下进行孵育（Englyst1和Berry2在pH 5.2下进行孵育）。这种方法直接用颗粒物测定抗性淀粉含量。Muir和O’Dea8开发的检测程序则将样品嚼碎，先用胃蛋白酶处理，添加胰α-淀粉酶和淀粉葡糖苷酶混合物，然后置于振荡水浴槽中，在pH 5.0，37 °C下孵育15个小时。通过离心回收残余颗粒物（含抗性淀粉），用乙酸盐缓冲液离心洗涤，并通过加热、加入二甲基亚砜（DMSO）和耐热α-淀粉酶共同作用，消化抗性淀粉。
Fausant等人9、Goni等人10、Akerberg等人11和Champ等人12对这些方法进行了改进，包括进行以下变更：使用的酶浓度、使用的酶类型（所有方法都使用胰α-淀粉酶，不再使用普鲁兰酶，一些方法改用淀粉葡糖苷酶）、样品预处理方式（嚼碎）、孵育步骤的pH值以及在α-淀粉酶孵育步骤后添加（或不添加）乙醇。所有改进都会对抗性淀粉的测定结果产生一定影响。
在开发当前改进的RS检测方法时，我们的目标是提供一种稳健而可靠的方法，以（尽可能地）模拟体内条件，并得出具有生理意义的数据（请参阅表1，第12页）。为此，我们13研究了胰α-淀粉酶浓度、孵育步骤pH值对测定结果的影响，麦芽糖对α-淀粉酶抑制作用的重要性，是否有必要添加淀粉葡糖苷酶，振荡和搅拌对测定结果的影响，以及在回收和分析颗粒状抗性淀粉的过程中面临的问题。如本手册所述，我们开发的方法能够测定样品中的抗性淀粉、可溶性淀粉和总淀粉含量。本方法可在24小时内分析24个样品。本检测程序已在美国分析化学家协会（AOAC International）和美国谷物化学家协会（AACC）14的组织下接受实验室间评估（参阅表2，第13页），并获得了两个机构的认可（AOAC官方方法2002.02；AACC方法32-40.01）。
原理：
将样品置于振荡水浴槽中，用胰α-淀粉酶和淀粉葡糖苷酶（AMG）在37 ℃下孵育16个小时。在此期间，在两种酶的共同作用下，非抗性淀粉被溶解并水解成D-葡萄糖。加入等体积的酒精或工业甲基化酒精（IMS，亦称变性酒精）来终止反应，通过离心回收颗粒状的抗性淀粉。用酒精或IMS（50% v/v）水溶液重悬并洗涤两次，回收颗粒，然后再离心，倾析去除游离液体。使用磁力搅拌器，在冰水浴槽中剧烈搅拌，将颗粒物中的抗性淀粉溶于2 M KOH中。用乙酸盐缓冲液中和溶液，然后用AMG将抗性淀粉定量水解成葡萄糖。用葡萄糖氧化酶/过氧化物酶试剂（GOPOD）测定D-葡萄糖，测得结果可表示样品的抗性淀粉含量。将原始上清液和洗涤液混合均匀，定容至100 mL，用GOPOD法测定D-葡萄糖含量，以此来测定非抗性淀粉（可溶性淀粉）含量。
适用性和准确性：
本方法适用于抗性淀粉含量（w/w）高于2%的样品。对于适用样品，标准误差通常在±5%以内。对于抗性淀粉含量（w/w）低于2%的样品，误差较大。
试剂盒：
可进行100次抗性淀粉测定的试剂盒。试剂盒包含完整的检测方法以及：
1 号瓶： 淀粉葡糖苷酶【12 mL，在 pH 5.0 和 40 °C 的条件下，以可溶性淀粉为底物时的酶活力为 3300 U/mL（或者，以对硝基苯基-β-麦芽糖苷*为底物时的酶活力为 200U/mL）】。淀粉葡糖苷酶溶液中应基本不含可检出的游离 D-葡萄糖。
在4 ℃下存放。有效期见单独的标签。
* 完 整 的酶活 检测程序可访问 www.megazyme.com 查 看 —— 产品代码：
R-AMGR3。
2 号瓶： 胰 α-淀粉酶（胰酶制剂，10 g，酶活为 3 Ceralpha Units/mg）。-10 ℃以下存放。有效期见单独的标签。
3 号瓶： GOPOD 试剂缓冲液。缓冲液（50 mL，pH 7.4），对羟基苯甲酸和叠氮化钠（0.09% w/v）。
在4 ℃下存放。有效期见单独的标签。
4 号瓶： GOPOD 试剂酶。葡萄糖氧化酶和过氧化物酶，以及 4-氨基安替比林。冻干粉。
-10 ℃以下存放。有效期见单独的标签。
5 号瓶： D-葡萄糖标准溶液（5 mL，1.0 mg/mL），溶于 0.2%（w/v）苯甲酸中。
室温存放。有效期见单独的标签。
6 号瓶： 抗性淀粉对照样品。抗性淀粉含量标注在标签上。
室温存放。有效期见单独的标签。
试剂溶液/悬液制备：
1. 直接使用 1 号瓶（3300 U/mL AMG 溶液）的内容物。该溶液粘稠，应使用正位移移液器（例如 Eppendorf Multipette®，带 5.0 mL Combitip®分液管）移取（分配 0.1 mL 等分溶液）。
同样需要准备的：
溶液1（稀释的AMG，300 U/mL）：用0.1 M马来酸钠缓冲液（0.1 M，pH 6.0；试剂1；未提供）将2 mL的1号瓶酶液（3300 U/mL AMG溶液）稀释至22 mL。将稀释后的溶液以5 mL/管进行分装，不使用时用聚丙烯容器冷冻储存。
可反复冻融，在-10 °C以下可稳定储存2年以上。
2. 现配现用，将 1 g 2 号瓶内容物（胰 α-淀粉酶）添加至 100 mL 马来酸钠缓冲液（100 mM，pH 6.0；试剂 1；未提供）中，搅拌 5 分钟，制成悬液。加入 1.0 mL溶液 1（稀释好的 AMG，300 U/mL）并混合均匀。以>1500 g 的离心力下离心10 分钟，并小心倒出上清液。这就是溶液 2（10 mg/mL 胰 α-淀粉酶，包含 3 U/mL AMG），应在制备当天使用。
3. 用蒸馏水将 GOPOD 试剂缓冲液稀释至 1 L（即溶液 3）。现配现用。
注意：
1. 在储存期间，浓缩缓冲液可能形成盐晶体。在使用蒸馏水将缓冲液稀释至1 L时，必须将其完全溶解。
2. 缓冲液中含0.09%（w/v）的叠氮化钠。这是一种有毒的化学物质，应按照要求小心处理。
4. 用 20 mL 溶液 3 溶解 GOPOD 试剂酶，并将得到的溶液定量转移至装有剩余溶液 3 的容器中。用铝箔包裹容器，以避免瓶内试剂受到光的照射。该试剂即为葡萄糖测定试剂（GOPOD 试剂）。
在 4 ℃下可稳定储存 1 个月以上，在-10 °C 以下可稳定储存 12 个月以上。
如果该试剂以冷冻状态储存，最好将其分装，在使用过程中仅冷冻/解冻一次。新配制的试剂可能呈淡黄色或淡粉色。在4 ℃储存期间，溶液颜色会逐渐转变为深粉红色。以蒸馏水为背景时，该溶液的吸光度应小于0.05。
5 & 6. 直接使用5号瓶和6号瓶内容物。
试剂（未提供）：
试剂应使用分析纯或同等级别。
1. 马来酸钠缓冲液（100 mM，pH 6.0）加 2 mM 二水氯化钙。
将23.2 g马来酸（Sigma，货号M0375）溶解于1600 mL蒸馏水中，并用4 M（160 g/L）氢氧化钠将pH值调节至6.0。加入0.6 g二水氯化钙（CaCl2.2H2O）并溶解。定容至2 L。
在4 ℃下储存。
2. 乙酸钠缓冲液（1.2 M，pH 3.8）。
将68.6 mL冰乙酸（1.05 g/mL）添加至800 mL蒸馏水中，并用4 M氢氧化钠将pH值调节至3.8。用蒸馏水定容至1 L。
在4 ℃下储存。
3. 乙酸钠缓冲液（100 mM，pH 4.5）。
将5.8 mL冰乙酸添加至900 mL蒸馏水中，并用4 M氢氧化钠将pH值调节至4.5。用蒸馏水定容至1 L。
在4 ℃下储存。
4. 氢氧化钾溶液（2 M）。
将112.2 g氢氧化钾（KOH）添加至900 mL去离子水中，搅拌溶解。定容至1 L。储存于密封容器中。
室温储存。
5. 约 50% v/v 乙醇（或 IMS）溶液。
将500 mL乙醇（95% v/v或99% v/v）或工业甲基化酒精（IMS；变性酒精；约95% v/v的乙醇加上5% v/v的甲醇）添加至500 mL水中。室温下储存于密封良好的容器中。
6. 99% v/v 乙醇
99%v/v的乙醇。或者，95% v/v的乙醇或工业甲基化酒精（IMS；变性酒精；约95% v/v的乙醇加上5% v/v的甲醇）也可以使用。
注意：
爱尔兰 Megazyme 提供一组抗性淀粉含量从 0.6%至 78% w/w 的质控样品（货号 K-RSTCL）。
设备（推荐）：
1. 磨碎机——离心磨碎机，配有 12 齿转子，筛网孔径为 1.0 mm，或类似设备。另外，小剂量试样也可使用旋风式磨碎机。
2. 绞肉机——手动或电动，配有 4.5 mm 筛网。
3. 台式离心机——可容纳 16×120 mm 玻璃试管，离心力约为 1,500 g（约 3,000 rpm）。
4. 振荡水浴装置（Grant OLS 200）（Grant 仪器剑桥有限公司）（或类似装置），在转盘上以每分钟100转的转速做线性运动（相当于每分钟200冲程的振荡速度），冲程长度为 35 mm，温度设定为 37 °C。
5. 水浴装置——可将温度维持在 50+/-0.1 °C。
6. 漩涡混合器。
7. 磁力搅拌器。
8. 磁力搅拌子——5×15 mm。
9. pH 计。
10. （数字）秒表/计时器。
11. 分析天平（精确到 0.1 mg）。
12. 分光光度计——可在 510 nm 波长下工作，最好配有流通池（光径长度为 10 mm）。
13. 移液器——可移取 100 μL 液体；配有一次性分液管。另外，也可使用手持式分液器。
14. 正位移移液器——配备 50 mL 分液管，可移取 2.0 mL、3.0 mL 和 4.0 mL 液体。
15. 康宁®培养管——螺旋盖，16×125 mm[Fisher 科技，型号 TKV-173-030B（试管）；TKV-178-020V（管盖）]，Fisher 科技，interact@fisher.co.uk。
16. 玻璃试管——16×100 mm，14 mL 容量。
17. 塑料材质的“午餐盒”，容量足以容纳试管架，并且可以作为冰水浴槽（见第10 页图 1）。
18. 温度计——可精确读取 37+/-0.1 °C 和 50+/-0.1 °C。
19. 容量瓶——100 mL、200 mL、500 mL、1 L 和 2 L 容量。
样品制备：
将约50 g谷物或冻干植株或食品放入磨碎机中磨碎，直至通过孔径为1.0 mm的筛网。将所有样品材料转移至一个宽口塑料罐中，通过振荡和颠倒摇晃混合均匀。工业用淀粉通常以细粉形态提供，不需要研磨。用手动或电动绞肉机绞碎新鲜样品（例如，豆粒罐头、香蕉、马铃薯），直至通过孔径约为4.5 mm的筛网。依照AOAC方法925.10（15）测定干样品的含水量，新鲜样品则依AOAC方法925.10，用烘箱干燥后进行冻干处理。
检测程序：
（a） 非抗性淀粉水解和增溶。
i. 准确称取 100±5 mg 样品，置于螺旋盖试管中（康宁®培养管；16×125 mm），轻轻敲击试管壁，确保样品落至管底。
注意：对于绞碎的豆粒罐头或食品等湿样品，样品质量为0.5 g左右（准确称量）。
这些样品的含水量通常为60%至80%。
ii. 向每个试管中加入 4.0 mL 溶液 2（胰 α-淀粉酶（10 mg/mL），含 3 U/mLAMG）混合溶液。
iii. 旋紧管盖，将试管置于旋涡混合器上混合均匀，然后将试管沿振荡器运动方向水平排列，放置在振荡水浴槽中（见第 11 页图 2 和图 3）。
iv. 将试管内容物在 37 ℃下，连续振荡（200 冲程/分钟）孵育 16 小时整（注意：对于振荡器的线性运动，100 转的转速相当于 200 冲程/分钟；前进 100 冲程，后退 100 冲程）。
v. 将试管从水浴槽中取出，用纸巾擦干外壁残留水珠。旋下管盖，加入 4.0 mL乙醇（99% v/v）或 IMS（99% v/v），边加入边在漩涡混合器上剧烈搅拌。
vi. 将试管在 1500 g（约 3000 rpm）下离心 10 分钟（不盖管盖）。
vii. 小心倒出上清液，再加入 2 mL 50% v/v 的乙醇（或 50% v/v 的 IMS），悬浮颗粒，边加入边在旋涡混合器上剧烈搅拌。再加入 6 mL 50% v/v 的乙醇，混合均匀，然后在 1500 g 下再次离心 10 分钟。
viii.倒出上清液，再重复一次上述重悬和离心步骤。
ix. 小心倒出上清液，并将试管倒置于吸水纸上，以吸干多余的液体。
（b） 测定抗性淀粉。
i. 向每个试管中加入 2 mL 2 M 氢氧化钾，并将磁力搅拌子（5×15mm）放入试管。将试管置于冰水中，在磁力搅拌器上搅拌约 20 分钟，使颗粒重悬（并溶解抗性淀粉）（图 1，第 10 页）。
注意：
1. 不要使用漩涡混合器搅拌，否则可能导致淀粉乳化。
2. 确保在加入氢氧化钾溶液的同时剧烈搅拌试管内容物。这可以避免生成难以溶解的淀粉团块。
ii. 向每个试管中加入 8 mL 1.2 M 乙酸钠缓冲液（pH 3.8），边加边用磁力搅拌器搅拌。立即添加 0.1 mL 溶液 1（AMG，3300 U/mL），混合均匀，然后将试管置于 50 ℃的水浴槽中。
iii. 孵育 30 分钟，间歇性的将试管置于旋涡混合器上搅拌。
iv. 对于抗性淀粉含量>10%的样品；（使用一个水洗瓶）将试管内容物定量转移至一个 100 mL 的容量瓶中。利用一个外部磁铁将磁力搅拌子悬浮在试管内，并用水洗瓶冲洗试管中的溶液。用蒸馏水定容至 100 mL 并混合均匀。将该溶液的等分溶液在 1500 g 下离心 10 分钟。
v. 对于抗性淀粉含量<10%的样品；直接将试管在 1500 g 下离心 10 分钟（不稀释）。对于这类样品，试管内的最终体积约为 10.3 mL（然而，具体体积因样品而异，湿样品的体积差异尤为显著，在计算时应考虑到溶液体积的差异）。
vi. 将稀释（步骤 iv）或未稀释（步骤 v）上清液的 0.1 mL 等分溶液（一式两份）转移至玻璃试管中（16×100 mm），加入 3.0 mL GOPOD 试剂，在 50 °C 下孵育20 分钟。
vii. 对照试剂空白样，测定每份溶液在 510 nm 波长下的吸光度值。
制备试剂空白样：将0.1 mL 100 mM的乙酸钠缓冲液（pH 4.5）与3.0 mL GOPOD试剂混合。
制备 D-葡萄糖标准溶液（一式四份）：将 0.1 mL 瓶 5（D-葡萄糖,1 mg/mL）与3.0 mL GOPOD 试剂混合。
（c） 测定非抗性（可溶性）淀粉。
i. 将初始孵育溶液离心得到的上清液[步骤（a）vii，第 8 页]与随后两次用 50%乙醇洗涤得到的上清液[步骤（a）viii 和（a）ix，第 8 页]合并至一个容量瓶中，用 100 mM 乙酸钠缓冲液（pH 4.5）定容至 100 mL。混合均匀。
ii. 取 0.1 mL 等分溶液（一式两份），加入 10 μL 溶液 1（稀释后的 AMG, 300 U/mL），在 50°C 下孵育 20 分钟。加入 3.0 mL GOPOD 试剂，在 50°C 下再孵育20 分钟。
iii. 以试剂空白为对照，测定溶液在 510 nm 波长下的吸光度值。
iv. 计算非抗性（可溶性）淀粉含量。
总淀粉含量为抗性淀粉与非抗性（可溶性）淀粉之和。
计算：
注：这些计算可通过使用Megazyme 的Mega-Calc™来简化, 您可以从Megazyme网站上相关产品页面进行下载（www.megayzme.com）。
按以下公式，计算试样中的抗性淀粉、非抗性（可溶性）淀粉和总淀粉含量（%，干重）：
式中：
ΔA =以试剂空白为对照读取的吸光度值（反应）值。
F =吸光度值到微克的转换系数（100 μg D-葡萄糖在GOPOD反应中的吸光度值已经确定，F=100（D-葡萄糖的质量 μg）除以100 μg D-葡萄糖的GOPOD吸光度值。
100/0.1 =体积校正（从100 mL中量取0.1 mL）。
1/1000 =微克至毫克的换算系数。
W =分析样品的干重
=“原样”质量×[（100-含水量）/100]。
100/W =抗性淀粉在样品质量中的百分比系数。
162/180 =将测定的游离D-葡萄糖转化为淀粉中的无水D-葡萄糖的系数。
10.3/0.1 =抗性淀粉含量为0至10%的样品（孵育溶液不进行稀释，且最终体积约
为10.3 mL）的容量校正（从10.3 mL中量取0.1mL）。湿样品的终体积更大，在计算时应考虑到这一点。
表 1：多种体外分析方法测得的抗性淀粉值与体内结果的比较
a 数值表示抗性淀粉占样品总淀粉含量的百分比。除 McCleary、Goni 等人（10）的数据以及 ActiStarR 的数值外，所有数据均来自 Champ 等人（16）。
b 来自 Goni 等人（10）。
c 来自 Goni 等人（10），将抗性淀粉含量表示为占总淀粉含量的百分比，假定大豆片的淀粉含量为 40%，玉米片的淀粉含量为 70%（基于类似原料的内部测定结果）。
d 除 McCleary 提供的数据（内部数据）外，由 Bernd Kettlitz、Cerestar、Vilvoorde、Belgium 慷慨提供的结果。“Englyst”数据由 Englyst Carbohydrate Services 提供；“Champ”数据由法国国家农业科学研究院（南特）提供，“Goni”数据由 Cerestar（维尔福德）提供。
表 2：酶解法测定淀粉样品和选定植物原料中抗性淀粉含量的方法性能（AOAC/AACC 实验室间研究结果）
a 在“原样”基础上计算（香蕉、芸豆和玉米片“原样”指的是冻干样品）
b（c） b=合作实验室数量（异常值实验室数量）
d r=2.8×Sr
e R=2.8×SR
f 高直链玉米淀粉
参考文献：
1. Englyst, H., Wiggins, H. L. & Cummins, J. H. (1982). Analyst, 107, 307-318.
2. Berry, C. S. (1986). J. Cereal Sci., 4, 301-314.
3. Englyst, H. N. & Cummins, J. H. (1985). Am. J. Clin. Nutr., 42, 778-787.
4. Englyst, H. N. & Cummins, J. H. (1986). Am. J. Clin. Nutr., 44, 42-50.
5. Englyst, H. N. & Cummins, J. H. (1987). Am. J. Clin. Nutr., 45, 423-431.
6. Englyst, H. N., Kingman, S. M. & Cummins, J. H. (1992). European J. Clin. Nutr., 46 (Suppl. 2), S33-S50.
7. Champ, M. (1992). Eur. J. Clin. Nutr., 46 (Suppl. 2), S51-S62.
8. Muir, J. G. & O’Dea, K. (1992). Am. J. Clin. Nutr., 56, 123-127.
9. Faisant, N., Planchot, V., Kozlowski, F., Pacouret, M. -P., Colonna, P. & Champ, M. (1995). Sciences des Aliments, 15, 83-89.
10. Goni, I., Garcia-Diz, E., Manas, E. & Saura-Calixto, F. (1996). Fd. Chem., 56, 445-449.
11. Akerberg, A. K. E., Liljberg, G. M., Granfeldt, Y. E., Drews, A. W. & Bjorck, M. E. (1998). Am. Soc. Nutr. Sciences, 128, 651-660.
12. Champ, M., Martin, L., Noah, L. & Gratas, M. (1999). “Complex Carbohydrates in Foods” (S. S. Cho, L. Prosky & M. Dreher, Eds.), pp. 169-187, Marcel Dekker, Inc., New York, USA.
13. McCleary, B. V. & Monaghan, D. A. (2002). J. AOAC International, 85, 665-675.
14. McCleary, B. V., McNally, M. & Rossiter, P. (2002). J. AOAC International, 85, 103-1111.
15. Official Methods of Analysis (2000). 17th Ed., AOAC INTERNATIONAL.
16. Champ, M., Kozlowski, F. & Lecannu, G. (2000). “Advanced Dietary Fibre Technology” (B. V. McCleary & L. Prosky, Eds.), pp 106-119, Blackwell Science Ltd., Oxford, UK.
AOAC 方法 2002.02
AACC 方法 32-40.01
CODEX 第二类方法
产品介绍：
根据定义，抗性淀粉（RS）是指不会被人类小肠中的酶水解的淀粉。抗性淀粉会进入大肠，在大肠中微生物的作用下，部分或全部发酵。抗性淀粉通常被视为总膳食纤维（TDF）的组分之一。
1982年，Englyst等人在测定非淀粉多糖时，首次发现了抗酶水解淀粉组分1。Berry2在这项研究的基础上加以扩展，开发了一种抗性淀粉测定程序。该程序结合了Englyst等人1采用的α-淀粉酶/普鲁兰酶处理方法，但省略了将样品加热至100 ℃的初始步骤，使检测条件更接近生理条件。经改进后，测得的样品抗性淀粉含量大幅提高。随后，Englyst等人3-5以健康的回肠造口患者为试验对象证实了这一发现。
到20世纪90年代初，研究人员已充分认识到抗性淀粉的生理功能。欧洲抗性淀粉协会（EURESTA）的研究计划开发了多种新的/改良方法6,7。Champ7方法基于Berry2方法进行改进，可直接测定抗性淀粉。主要改进包括将样品量从10 mg增至100 mg，只使用胰腺α-淀粉酶（而不是与Englyst1和Berry2一样使用胰腺α-淀粉酶加普鲁兰酶）来消化样品，以及在pH 6.9下进行孵育（Englyst1和Berry2在pH 5.2下进行孵育）。这种方法直接用颗粒物测定抗性淀粉含量。Muir和O’Dea8开发的检测程序则将样品嚼碎，先用胃蛋白酶处理，添加胰α-淀粉酶和淀粉葡糖苷酶混合物，然后置于振荡水浴槽中，在pH 5.0，37 °C下孵育15个小时。通过离心回收残余颗粒物（含抗性淀粉），用乙酸盐缓冲液离心洗涤，并通过加热、加入二甲基亚砜（DMSO）和耐热α-淀粉酶共同作用，消化抗性淀粉。
Fausant等人9、Goni等人10、Akerberg等人11和Champ等人12对这些方法进行了改进，包括进行以下变更：使用的酶浓度、使用的酶类型（所有方法都使用胰α-淀粉酶，不再使用普鲁兰酶，一些方法改用淀粉葡糖苷酶）、样品预处理方式（嚼碎）、孵育步骤的pH值以及在α-淀粉酶孵育步骤后添加（或不添加）乙醇。所有改进都会对抗性淀粉的测定结果产生一定影响。
在开发当前改进的RS检测方法时，我们的目标是提供一种稳健而可靠的方法，以（尽可能地）模拟体内条件，并得出具有生理意义的数据（请参阅表1，第12页）。为此，我们13研究了胰α-淀粉酶浓度、孵育步骤pH值对测定结果的影响，麦芽糖对α-淀粉酶抑制作用的重要性，是否有必要添加淀粉葡糖苷酶，振荡和搅拌对测定结果的影响，以及在回收和分析颗粒状抗性淀粉的过程中面临的问题。如本手册所述，我们开发的方法能够测定样品中的抗性淀粉、可溶性淀粉和总淀粉含量。本方法可在24小时内分析24个样品。本检测程序已在美国分析化学家协会（AOAC International）和美国谷物化学家协会（AACC）14的组织下接受实验室间评估（参阅表2，第13页），并获得了两个机构的认可（AOAC官方方法2002.02；AACC方法32-40.01）。
原理：
将样品置于振荡水浴槽中，用胰α-淀粉酶和淀粉葡糖苷酶（AMG）在37 ℃下孵育16个小时。在此期间，在两种酶的共同作用下，非抗性淀粉被溶解并水解成D-葡萄糖。加入等体积的酒精或工业甲基化酒精（IMS，亦称变性酒精）来终止反应，通过离心回收颗粒状的抗性淀粉。用酒精或IMS（50% v/v）水溶液重悬并洗涤两次，回收颗粒，然后再离心，倾析去除游离液体。使用磁力搅拌器，在冰水浴槽中剧烈搅拌，将颗粒物中的抗性淀粉溶于2 M KOH中。用乙酸盐缓冲液中和溶液，然后用AMG将抗性淀粉定量水解成葡萄糖。用葡萄糖氧化酶/过氧化物酶试剂（GOPOD）测定D-葡萄糖，测得结果可表示样品的抗性淀粉含量。将原始上清液和洗涤液混合均匀，定容至100 mL，用GOPOD法测定D-葡萄糖含量，以此来测定非抗性淀粉（可溶性淀粉）含量。
适用性和准确性：
本方法适用于抗性淀粉含量（w/w）高于2%的样品。对于适用样品，标准误差通常在±5%以内。对于抗性淀粉含量（w/w）低于2%的样品，误差较大。
试剂盒：
可进行100次抗性淀粉测定的试剂盒。试剂盒包含完整的检测方法以及：
1 号瓶： 淀粉葡糖苷酶【12 mL，在 pH 5.0 和 40 °C 的条件下，以可溶性淀粉为底物时的酶活力为 3300 U/mL（或者，以对硝基苯基-β-麦芽糖苷*为底物时的酶活力为 200U/mL）】。淀粉葡糖苷酶溶液中应基本不含可检出的游离 D-葡萄糖。
在4 ℃下存放。有效期见单独的标签。
* 完 整 的酶活 检测程序可访问 www.megazyme.com 查 看 —— 产品代码：
R-AMGR3。
2 号瓶： 胰 α-淀粉酶（胰酶制剂，10 g，酶活为 3 Ceralpha Units/mg）。-10 ℃以下存放。有效期见单独的标签。
3 号瓶： GOPOD 试剂缓冲液。缓冲液（50 mL，pH 7.4），对羟基苯甲酸和叠氮化钠（0.09% w/v）。
在4 ℃下存放。有效期见单独的标签。
4 号瓶： GOPOD 试剂酶。葡萄糖氧化酶和过氧化物酶，以及 4-氨基安替比林。冻干粉。
-10 ℃以下存放。有效期见单独的标签。
5 号瓶： D-葡萄糖标准溶液（5 mL，1.0 mg/mL），溶于 0.2%（w/v）苯甲酸中。
室温存放。有效期见单独的标签。
6 号瓶： 抗性淀粉对照样品。抗性淀粉含量标注在标签上。
室温存放。有效期见单独的标签。
试剂溶液/悬液制备：
1. 直接使用 1 号瓶（3300 U/mL AMG 溶液）的内容物。该溶液粘稠，应使用正位移移液器（例如 Eppendorf Multipette®，带 5.0 mL Combitip®分液管）移取（分配 0.1 mL 等分溶液）。
同样需要准备的：
溶液1（稀释的AMG，300 U/mL）：用0.1 M马来酸钠缓冲液（0.1 M，pH 6.0；试剂1；未提供）将2 mL的1号瓶酶液（3300 U/mL AMG溶液）稀释至22 mL。将稀释后的溶液以5 mL/管进行分装，不使用时用聚丙烯容器冷冻储存。
可反复冻融，在-10 °C以下可稳定储存2年以上。
2. 现配现用，将 1 g 2 号瓶内容物（胰 α-淀粉酶）添加至 100 mL 马来酸钠缓冲液（100 mM，pH 6.0；试剂 1；未提供）中，搅拌 5 分钟，制成悬液。加入 1.0 mL溶液 1（稀释好的 AMG，300 U/mL）并混合均匀。以>1500 g 的离心力下离心10 分钟，并小心倒出上清液。这就是溶液 2（10 mg/mL 胰 α-淀粉酶，包含 3 U/mL AMG），应在制备当天使用。
3. 用蒸馏水将 GOPOD 试剂缓冲液稀释至 1 L（即溶液 3）。现配现用。
注意：
1. 在储存期间，浓缩缓冲液可能形成盐晶体。在使用蒸馏水将缓冲液稀释至1 L时，必须将其完全溶解。
2. 缓冲液中含0.09%（w/v）的叠氮化钠。这是一种有毒的化学物质，应按照要求小心处理。
4. 用 20 mL 溶液 3 溶解 GOPOD 试剂酶，并将得到的溶液定量转移至装有剩余溶液 3 的容器中。用铝箔包裹容器，以避免瓶内试剂受到光的照射。该试剂即为葡萄糖测定试剂（GOPOD 试剂）。
在 4 ℃下可稳定储存 1 个月以上，在-10 °C 以下可稳定储存 12 个月以上。
如果该试剂以冷冻状态储存，最好将其分装，在使用过程中仅冷冻/解冻一次。新配制的试剂可能呈淡黄色或淡粉色。在4 ℃储存期间，溶液颜色会逐渐转变为深粉红色。以蒸馏水为背景时，该溶液的吸光度应小于0.05。
5 & 6. 直接使用5号瓶和6号瓶内容物。
试剂（未提供）：
试剂应使用分析纯或同等级别。
1. 马来酸钠缓冲液（100 mM，pH 6.0）加 2 mM 二水氯化钙。
将23.2 g马来酸（Sigma，货号M0375）溶解于1600 mL蒸馏水中，并用4 M（160 g/L）氢氧化钠将pH值调节至6.0。加入0.6 g二水氯化钙（CaCl2.2H2O）并溶解。定容至2 L。
在4 ℃下储存。
2. 乙酸钠缓冲液（1.2 M，pH 3.8）。
将68.6 mL冰乙酸（1.05 g/mL）添加至800 mL蒸馏水中，并用4 M氢氧化钠将pH值调节至3.8。用蒸馏水定容至1 L。
在4 ℃下储存。
3. 乙酸钠缓冲液（100 mM，pH 4.5）。
将5.8 mL冰乙酸添加至900 mL蒸馏水中，并用4 M氢氧化钠将pH值调节至4.5。用蒸馏水定容至1 L。
在4 ℃下储存。
4. 氢氧化钾溶液（2 M）。
将112.2 g氢氧化钾（KOH）添加至900 mL去离子水中，搅拌溶解。定容至1 L。储存于密封容器中。
室温储存。
5. 约 50% v/v 乙醇（或 IMS）溶液。
将500 mL乙醇（95% v/v或99% v/v）或工业甲基化酒精（IMS；变性酒精；约95% v/v的乙醇加上5% v/v的甲醇）添加至500 mL水中。室温下储存于密封良好的容器中。
6. 99% v/v 乙醇
99%v/v的乙醇。或者，95% v/v的乙醇或工业甲基化酒精（IMS；变性酒精；约95% v/v的乙醇加上5% v/v的甲醇）也可以使用。
注意：
爱尔兰 Megazyme 提供一组抗性淀粉含量从 0.6%至 78% w/w 的质控样品（货号 K-RSTCL）。
设备（推荐）：
1. 磨碎机——离心磨碎机，配有 12 齿转子，筛网孔径为 1.0 mm，或类似设备。另外，小剂量试样也可使用旋风式磨碎机。
2. 绞肉机——手动或电动，配有 4.5 mm 筛网。
3. 台式离心机——可容纳 16×120 mm 玻璃试管，离心力约为 1,500 g（约 3,000 rpm）。
4. 振荡水浴装置（Grant OLS 200）（Grant 仪器剑桥有限公司）（或类似装置），在转盘上以每分钟100转的转速做线性运动（相当于每分钟200冲程的振荡速度），冲程长度为 35 mm，温度设定为 37 °C。
5. 水浴装置——可将温度维持在 50+/-0.1 °C。
6. 漩涡混合器。
7. 磁力搅拌器。
8. 磁力搅拌子——5×15 mm。
9. pH 计。
10. （数字）秒表/计时器。
11. 分析天平（精确到 0.1 mg）。
12. 分光光度计——可在 510 nm 波长下工作，最好配有流通池（光径长度为 10 mm）。
13. 移液器——可移取 100 μL 液体；配有一次性分液管。另外，也可使用手持式分液器。
14. 正位移移液器——配备 50 mL 分液管，可移取 2.0 mL、3.0 mL 和 4.0 mL 液体。
15. 康宁®培养管——螺旋盖，16×125 mm[Fisher 科技，型号 TKV-173-030B（试管）；TKV-178-020V（管盖）]，Fisher 科技，interact@fisher.co.uk。
16. 玻璃试管——16×100 mm，14 mL 容量。
17. 塑料材质的“午餐盒”，容量足以容纳试管架，并且可以作为冰水浴槽（见第10 页图 1）。
18. 温度计——可精确读取 37+/-0.1 °C 和 50+/-0.1 °C。
19. 容量瓶——100 mL、200 mL、500 mL、1 L 和 2 L 容量。
样品制备：
将约50 g谷物或冻干植株或食品放入磨碎机中磨碎，直至通过孔径为1.0 mm的筛网。将所有样品材料转移至一个宽口塑料罐中，通过振荡和颠倒摇晃混合均匀。工业用淀粉通常以细粉形态提供，不需要研磨。用手动或电动绞肉机绞碎新鲜样品（例如，豆粒罐头、香蕉、马铃薯），直至通过孔径约为4.5 mm的筛网。依照AOAC方法925.10（15）测定干样品的含水量，新鲜样品则依AOAC方法925.10，用烘箱干燥后进行冻干处理。
检测程序：
（a） 非抗性淀粉水解和增溶。
i. 准确称取 100±5 mg 样品，置于螺旋盖试管中（康宁®培养管；16×125 mm），轻轻敲击试管壁，确保样品落至管底。
注意：对于绞碎的豆粒罐头或食品等湿样品，样品质量为0.5 g左右（准确称量）。
这些样品的含水量通常为60%至80%。
ii. 向每个试管中加入 4.0 mL 溶液 2（胰 α-淀粉酶（10 mg/mL），含 3 U/mLAMG）混合溶液。
iii. 旋紧管盖，将试管置于旋涡混合器上混合均匀，然后将试管沿振荡器运动方向水平排列，放置在振荡水浴槽中（见第 11 页图 2 和图 3）。
iv. 将试管内容物在 37 ℃下，连续振荡（200 冲程/分钟）孵育 16 小时整（注意：对于振荡器的线性运动，100 转的转速相当于 200 冲程/分钟；前进 100 冲程，后退 100 冲程）。
v. 将试管从水浴槽中取出，用纸巾擦干外壁残留水珠。旋下管盖，加入 4.0 mL乙醇（99% v/v）或 IMS（99% v/v），边加入边在漩涡混合器上剧烈搅拌。
vi. 将试管在 1500 g（约 3000 rpm）下离心 10 分钟（不盖管盖）。
vii. 小心倒出上清液，再加入 2 mL 50% v/v 的乙醇（或 50% v/v 的 IMS），悬浮颗粒，边加入边在旋涡混合器上剧烈搅拌。再加入 6 mL 50% v/v 的乙醇，混合均匀，然后在 1500 g 下再次离心 10 分钟。
viii.倒出上清液，再重复一次上述重悬和离心步骤。
ix. 小心倒出上清液，并将试管倒置于吸水纸上，以吸干多余的液体。
（b） 测定抗性淀粉。
i. 向每个试管中加入 2 mL 2 M 氢氧化钾，并将磁力搅拌子（5×15mm）放入试管。将试管置于冰水中，在磁力搅拌器上搅拌约 20 分钟，使颗粒重悬（并溶解抗性淀粉）（图 1，第 10 页）。
注意：
1. 不要使用漩涡混合器搅拌，否则可能导致淀粉乳化。
2. 确保在加入氢氧化钾溶液的同时剧烈搅拌试管内容物。这可以避免生成难以溶解的淀粉团块。
ii. 向每个试管中加入 8 mL 1.2 M 乙酸钠缓冲液（pH 3.8），边加边用磁力搅拌器搅拌。立即添加 0.1 mL 溶液 1（AMG，3300 U/mL），混合均匀，然后将试管置于 50 ℃的水浴槽中。
iii. 孵育 30 分钟，间歇性的将试管置于旋涡混合器上搅拌。
iv. 对于抗性淀粉含量>10%的样品；（使用一个水洗瓶）将试管内容物定量转移至一个 100 mL 的容量瓶中。利用一个外部磁铁将磁力搅拌子悬浮在试管内，并用水洗瓶冲洗试管中的溶液。用蒸馏水定容至 100 mL 并混合均匀。将该溶液的等分溶液在 1500 g 下离心 10 分钟。
v. 对于抗性淀粉含量<10%的样品；直接将试管在 1500 g 下离心 10 分钟（不稀释）。对于这类样品，试管内的最终体积约为 10.3 mL（然而，具体体积因样品而异，湿样品的体积差异尤为显著，在计算时应考虑到溶液体积的差异）。
vi. 将稀释（步骤 iv）或未稀释（步骤 v）上清液的 0.1 mL 等分溶液（一式两份）转移至玻璃试管中（16×100 mm），加入 3.0 mL GOPOD 试剂，在 50 °C 下孵育20 分钟。
vii. 对照试剂空白样，测定每份溶液在 510 nm 波长下的吸光度值。
制备试剂空白样：将0.1 mL 100 mM的乙酸钠缓冲液（pH 4.5）与3.0 mL GOPOD试剂混合。
制备 D-葡萄糖标准溶液（一式四份）：将 0.1 mL 瓶 5（D-葡萄糖,1 mg/mL）与3.0 mL GOPOD 试剂混合。
（c） 测定非抗性（可溶性）淀粉。
i. 将初始孵育溶液离心得到的上清液[步骤（a）vii，第 8 页]与随后两次用 50%乙醇洗涤得到的上清液[步骤（a）viii 和（a）ix，第 8 页]合并至一个容量瓶中，用 100 mM 乙酸钠缓冲液（pH 4.5）定容至 100 mL。混合均匀。
ii. 取 0.1 mL 等分溶液（一式两份），加入 10 μL 溶液 1（稀释后的 AMG, 300 U/mL），在 50°C 下孵育 20 分钟。加入 3.0 mL GOPOD 试剂，在 50°C 下再孵育20 分钟。
iii. 以试剂空白为对照，测定溶液在 510 nm 波长下的吸光度值。
iv. 计算非抗性（可溶性）淀粉含量。
总淀粉含量为抗性淀粉与非抗性（可溶性）淀粉之和。
计算：
注：这些计算可通过使用Megazyme 的Mega-Calc™来简化, 您可以从Megazyme网站上相关产品页面进行下载（www.megayzme.com）。
按以下公式，计算试样中的抗性淀粉、非抗性（可溶性）淀粉和总淀粉含量（%，干重）：
ΔA =以试剂空白为对照读取的吸光度值（反应）值。
F =吸光度值到微克的转换系数（100 μg D-葡萄糖在GOPOD反应中的吸光度值已经确定，F=100（D-葡萄糖的质量 μg）除以100 μg D-葡萄糖的GOPOD吸光度值。
100/0.1 =体积校正（从100 mL中量取0.1 mL）。
1/1000 =微克至毫克的换算系数。
W =分析样品的干重
=“原样”质量×[（100-含水量）/100]。
100/W =抗性淀粉在样品质量中的百分比系数。
162/180 =将测定的游离D-葡萄糖转化为淀粉中的无水D-葡萄糖的系数。
10.3/0.1 =抗性淀粉含量为0至10%的样品（孵育溶液不进行稀释，且最终体积约
为10.3 mL）的容量校正（从10.3 mL中量取0.1mL）。湿样品的终体积更大，在计算时应考虑到这一点。
表 1：多种体外分析方法测得的抗性淀粉值与体内结果的比较
a 数值表示抗性淀粉占样品总淀粉含量的百分比。除 McCleary、Goni 等人（10）的数据以及 ActiStarR 的数值外，所有数据均来自 Champ 等人（16）。b 来自 Goni 等人（10）。
c 来自 Goni 等人（10），将抗性淀粉含量表示为占总淀粉含量的百分比，假定大豆片的淀粉含量为 40%，玉米片的淀粉含量为 70%（基于类似原料的内部测定结果）。
d 除 McCleary 提供的数据（内部数据）外，由 Bernd Kettlitz、Cerestar、Vilvoorde、Belgium 慷慨提供的结果。“Englyst”数据由 Englyst Carbohydrate Services 提供；“Champ”数据由法国国家农业科学研究院（南特）提供，“Goni”数据由 Cerestar（维尔福德）提供。
表 2：酶解法测定淀粉样品和选定植物原料中抗性淀粉含量的方法性能（AOAC/AACC 实验室间研究结果）
a 在“原样”基础上计算（香蕉、芸豆和玉米片“原样”指的是冻干样品）b（c） b=合作实验室数量（异常值实验室数量）
d r=2.8×Sr
e R=2.8×SR
f 高直链玉米淀粉
参考文献：1. Englyst, H., Wiggins, H. L. & Cummins, J. H. (1982). Analyst, 107, 307-318.
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7. Champ, M. (1992). Eur. J. Clin. Nutr., 46 (Suppl. 2), S51-S62.
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10. Goni, I., Garcia-Diz, E., Manas, E. & Saura-Calixto, F. (1996). Fd. Chem., 56, 445-449.
11. Akerberg, A. K. E., Liljberg, G. M., Granfeldt, Y. E., Drews, A. W. & Bjorck, M. E. (1998). Am. Soc. Nutr. Sciences, 128, 651-660.
12. Champ, M., Martin, L., Noah, L. & Gratas, M. (1999). “Complex Carbohydrates in Foods” (S. S. Cho, L. Prosky & M. Dreher, Eds.), pp. 169-187, Marcel Dekker, Inc., New York, USA.
13. McCleary, B. V. & Monaghan, D. A. (2002). J. AOAC International, 85, 665-675.
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