使用Megazyme试剂盒对支链淀粉和直链淀粉进行测定
2025-02-24 来源:本站 点击次数:36
简介：
谷物淀粉的许多特性决定了它们是否适合特定的最终用途，取决于它们的直链淀粉/支链淀粉比率。这些特性包括凝胶化和凝胶化特性、溶解性、抗性淀粉的形成，以及大米的烹饪和全谷类的质地特征。因此，淀粉直链淀粉含量的测定是淀粉加工的重要质量指标。1-5
谷物淀粉中的直链淀粉最常见的测定方法是电位法、安培法或比色法测定直链淀粉的碘结合能力，并由此形成直链淀粉-碘包合物。然而，这些方法存在不确定性。支链淀粉-碘络合物也会形成，这些会降低用非比色法测得的游离碘浓度，并可能以与比色法中的直链淀粉-碘络合物在类似波长下吸收。这些复合物导致对直链淀粉的高估，需要进行修正。Gibson等人详细介绍了在使用这些方法时遇到的许多其他问题。6-1011
支链淀粉与凝集素刀豆蛋白A（cona）的特殊形成为淀粉中直链淀粉的测定提供了一种不受这些不确定性影响的替代方法。在一定的pH、温度和离子强度条件下，cona以α-D-吡喃葡萄糖或α-D-甘露聚糖为基元，在多个非还原性端基上与多个支链多糖形成沉淀。因此，cona有效地复合了淀粉的支链淀粉组分，而不是主要的直链淀粉组分。12-13
本手册中描述的程序是对Yun和Matheson（1990）开发的CONA方法的修改。它在分析前使用乙醇预处理步骤去除脂质[修改自Morrison和Laignelet（1983）]。13137
原则：
淀粉样品在二甲基亚砜（DMSO）中加热完全分散。通过在乙醇中沉淀淀粉并回收沉淀的淀粉来去除脂质。在醋酸盐/盐溶液中溶解沉淀样品后，通过添加cona使支链淀粉沉淀，并通过离心分离除去支链淀粉。上清液中的一小份直链淀粉被酶水解成D-葡萄糖，并使用葡萄糖氧化酶/过氧化物酶试剂对其进行分析。总淀粉，在一份单独的醋酸盐/盐溶液中，同样地水解为D-葡萄糖，并通过葡萄糖氧化酶/过氧化物酶进行色度测量。淀粉样品中的直链淀粉浓度估计为cona沉淀样品上清液510nm处的GOPOD吸光度与总淀粉样品上清液吸光度的比值。
本程序适用于所有纯淀粉样品和谷类面粉。
准确度：
对一组样品的重复分析产生了重复性（实验室内），纯淀粉的相对标准偏差<5%，谷类粉的相对标准偏差为~10%。
套件：
Megazyme提供适合执行100次分析的试剂盒。
试剂盒包含完整的分析方法以及：
试剂溶液/悬浮液的制备：
1. 将1号瓶的内容物溶解在50毫升CONA溶剂（缓冲液3，第4页）中。分为适当大小的小份，并在使用之间储存在-10°C以下的聚丙烯管中，如有可能，在使用过程中保持冷却。在-10℃以下稳定2年以上。
2. 将瓶2的内容物溶解在20 mL醋酸钠缓冲液（100 mM，pH 4.5）中。分为适当大小的等分试样，并在使用期间储存在-10°C以下的聚丙烯管中，如有可能，在使用过程中保持冷却。在-10℃以下稳定2年以上。
3. 将瓶3（GOPOD试剂缓冲液）的内容物稀释至此溶液（1）为蒸馏水。立即使用。
注：
1. 储存时，盐晶体可能在浓缩缓冲液中形成。当用蒸馏水将缓冲液稀释至1L时，必须将其完全溶解。
2. 该缓冲液含有0.095%（w/v）叠氮化钠。
这是一种有毒的化学物质，应该进行相应的处理。
4. 用20毫升溶液3溶解4号瓶的内容物，并将其定量转移到含有剩余溶液3的瓶子中。用铝箔盖住这个瓶子，以保护密封的试剂不受光照。这是葡萄糖测定试剂（GOPOD试剂）。在2-5°C或低于-10°C下存放超过12个月，可稳定~3个月。
5号和6号。使用提供的瓶子5和6的内容物。
室温下可稳定5年以上。
缓冲液和溶剂（未提供）：
1 乙酸钠缓冲液（100 mM，pH 4.5）
向900 mL蒸馏水中添加5.9 mL冰醋酸（1.05 g/mL）。通过添加1 M（4 g/100 mL）氢氧化钠溶液（需要大约30 mL），将pH值调节至pH 4.5。加入0.2g叠氮化钠，调节体积至1L，室温下稳定2年以上。
2 浓缩ConA溶剂（600 mM，pH 6.4醋酸钠缓冲液）
溶解49.2 g无水乙酸钠（Sigma cat。不。
71183），175.5 g氯化钠（Sigma cat。编号：S7653），
0.5 g CaCl.2HO（Sigma cat。编号C5080），0.7 g MgCl.6HO（Sigma cat。编号M2670）和0.7 g MnCl.4HO（Sigma cat。在900毫升蒸馏水中。逐滴加入冰醋酸，调节pH至6.4，然后用蒸馏水将体积调节至1L。在4℃下稳定2周。222222
注：制备此缓冲混合物时，必须非常小心地调整pH值。如果pH值显著低于6.4，则会形成沉淀，并且在pH值调整时不会重新溶解。因此，必须丢弃该缓冲液并制备新的一批。
三。CONA溶剂（工作浓度）
用蒸馏水将30ml浓缩cona溶剂稀释至100ml。准备当天使用。
4 二甲基亚砜
分析试剂等级（BDH Analar cat。编号10323）。室温下稳定5年。
设备（推荐）：
1. 玻璃器皿：
- 容量瓶（25ml）；
- 玻璃试管（16 x 120毫米，15毫升）；
- 螺旋盖样品管（Kimax）（10 mL）。®
2. 微量移液器，用于分配50-1000µL（例如Gilson Piptman）。
3. 容积式移液器，如Eppendorf Multipette。®
4. Eppendorf微型胶管（容量2.0 mL）。®
5. 开水浴。
6. 台式离心机（容量2000g）。
7. 涡流混合器（如IKA Yellowline试管振荡器TTS2）。®
8. 分光光度计（设置为510 nm）。
9. 停车钟。
10. 分析天平。
11. 微型食品（容量14000克）。
12. 恒温水浴器设置为40°C。
注意事项：
淀粉样品必须按照说明用乙醇预处理，以去除脂质。如果样品不经乙醇处理，一些样品中的直链淀粉含量可能会低估50%。
化验程序：
A、 淀粉预处理
1. 准确称取淀粉或面粉样品（20-25毫克精确到0.1毫克）到一个10毫升螺旋盖的Kimax样品管中。记录样品重量，精确至0.1 mg。®
注：每批包括一个参考样品。每五个试样重复一次。
2. 向试管中加入1ml二甲基亚砜，同时在涡流混合器上以低速轻轻搅拌。盖住试管，在沸水浴中加热试管内容物，直到样品完全分散（大约1分钟）。确保没有凝胶状的淀粉块残留。
3. 在涡流混合器上高速强力混合密封管的内容物，将管放入沸水浴中加热15分钟，在涡流混合器上间歇高速搅拌。
4. 将试管在室温下储存约5分钟，并在涡流混合器上连续搅拌，添加2ml 95%（v/v）乙醇。再加4毫升乙醇，盖上试管，倒置搅拌。会形成淀粉沉淀物。让试管静置15分钟（或过夜，如果需要）。
5. 离心试管（2000 g）5分钟，丢弃上清液，并将试管放在纸巾上10分钟。确保已排出所有乙醇。在随后的直链淀粉和淀粉测定中使用颗粒。
6. 向淀粉颗粒中添加2ml二甲基亚砜（用温和的涡流混合）。将试管放在沸水浴中15分钟，偶尔搅拌。确保没有胶状肿块。
7. 从沸水浴中取出试管后，立即添加4 mL Con A溶剂（缓冲液3；第4页），充分混合，然后定量转移试管内容物（用Con A溶剂反复洗涤）至25 mL容量瓶中。用CONA溶剂（这是溶液A）稀释至一定体积。如有必要，用Whatman 1号滤纸过滤此溶液（整个面粉样品需要此步骤）。®
注：该溶液应在2小时内进行分析。
B、 支链淀粉的沉淀与直链淀粉的测定
1. 将1.0 mL溶液A转移到2.0 mL Eppendorf microfuge试管中。添加0.50 mL CONA溶液（瓶1），盖上试管并通过反复倒置轻轻混合。避免样品起泡。®
2. 让试管在室温下静置1小时。在室温下，将14000 g在微型食品中离心10分钟。
注：
1. 不能将CONA溶剂（即上文A节所述的溶液A）中的样品放置较长时间，因为直链淀粉会倾向于逆行和沉淀。
2. 在室温下，支链淀粉的有效cona沉淀（以上步骤B1）所需的时间为1h。
然而，这些溶液不应超过2小时，因为直链淀粉将趋于逆行。
3. 在这个过程中，用乙醇对样品进行预处理有一个额外的优点，即去除样品中可能干扰测定的任何可溶性糖。
3. 将1ml上清液转移至15ml离心管中。添加3 mL 100 mM乙酸钠缓冲液，pH值4.5。这会使pH值降至~5。混合所有成分，轻轻塞上塞子（用大理石），在沸水浴中加热5分钟，使cona变性。
4. 将试管置于40°C的水浴中，使其平衡5分钟。添加0.1 mL淀粉葡萄糖苷酶/α-淀粉酶混合物（第3页；溶液2），并在40°C下培养30分钟。在2000 g下离心试管5分钟。
5. 向1.0 mL上清液的等分试样中添加4 mL GOPOD
试剂（试剂B）。在40°C下培养20分钟。同时培养试剂空白和D-葡萄糖对照品。
注：
通过将1.0 mL 100 mM醋酸钠缓冲液（缓冲液1；第4页）添加到4.0 mL GOPOD试剂中，并在40℃下培养20 min来制备试剂空白。
D-葡萄糖控制（副本）包括0.1 mL D-葡萄糖标准溶液（1 mg/mL）、0.9 mL醋酸钠缓冲液和4.0 mL GOPOD试剂。计算中不使用该值，但我们建议执行该值以确保该部分分析没有问题。
6.在510 nm处，对照试剂空白，读取每个样品和D-葡萄糖对照品的吸光度。
C、 总淀粉的测定
1. 将0.5 mL溶液A与4 mL 100 mM乙酸钠缓冲液（pH值4.5）混合。
2. 添加0.1 mL淀粉葡萄糖苷酶/α-淀粉酶溶液，并在40°C下培养10分钟。
3. 移取1.0 mL等分试样（一式两份）于玻璃试管中，加入4 mL GOPOD试剂（溶液4），混匀。在40°C下培养20分钟。该培养应与上述B节中的样品和标准品同时进行。
谷物淀粉的许多特性决定了它们是否适合特定的最终用途，取决于它们的直链淀粉/支链淀粉比率。这些特性包括凝胶化和凝胶化特性、溶解性、抗性淀粉的形成，以及大米的烹饪和全谷类的质地特征。因此，淀粉直链淀粉含量的测定是淀粉加工的重要质量指标。1-5
谷物淀粉中的直链淀粉最常见的测定方法是电位法、安培法或比色法测定直链淀粉的碘结合能力，并由此形成直链淀粉-碘包合物。然而，这些方法存在不确定性。支链淀粉-碘络合物也会形成，这些会降低用非比色法测得的游离碘浓度，并可能以与比色法中的直链淀粉-碘络合物在类似波长下吸收。这些复合物导致对直链淀粉的高估，需要进行修正。Gibson等人详细介绍了在使用这些方法时遇到的许多其他问题。6-1011
支链淀粉与凝集素刀豆蛋白A（cona）的特殊形成为淀粉中直链淀粉的测定提供了一种不受这些不确定性影响的替代方法。在一定的pH、温度和离子强度条件下，cona以α-D-吡喃葡萄糖或α-D-甘露聚糖为基元，在多个非还原性端基上与多个支链多糖形成沉淀。因此，cona有效地复合了淀粉的支链淀粉组分，而不是主要的直链淀粉组分。12-13
本手册中描述的程序是对Yun和Matheson（1990）开发的CONA方法的修改。它在分析前使用乙醇预处理步骤去除脂质[修改自Morrison和Laignelet（1983）]。13137
原则：
淀粉样品在二甲基亚砜（DMSO）中加热完全分散。通过在乙醇中沉淀淀粉并回收沉淀的淀粉来去除脂质。在醋酸盐/盐溶液中溶解沉淀样品后，通过添加cona使支链淀粉沉淀，并通过离心分离除去支链淀粉。上清液中的一小份直链淀粉被酶水解成D-葡萄糖，并使用葡萄糖氧化酶/过氧化物酶试剂对其进行分析。总淀粉，在一份单独的醋酸盐/盐溶液中，同样地水解为D-葡萄糖，并通过葡萄糖氧化酶/过氧化物酶进行色度测量。淀粉样品中的直链淀粉浓度估计为cona沉淀样品上清液510nm处的GOPOD吸光度与总淀粉样品上清液吸光度的比值。
本程序适用于所有纯淀粉样品和谷类面粉。
准确度：
对一组样品的重复分析产生了重复性（实验室内），纯淀粉的相对标准偏差<5%，谷类粉的相对标准偏差为~10%。
套件：
Megazyme提供适合执行100次分析的试剂盒。
试剂盒包含完整的分析方法以及：
| 瓶子1： | 冻干cona。 |
| 在-10℃以下稳定5年以上。 | |
| 瓶子2： | 淀粉葡萄糖苷酶[200 U对硝基苯基 |
| β-麦芽糖苷（即在pH值为4.5的条件下，淀粉上的β-麦芽糖苷为3300 U | |
| 40°C）]加真菌α-淀粉酶（Ceralpha 500 U） | |
| pH值为5.0和40°C的试剂），2 mL。 | |
| 在4°C下稳定>5年。 | |
| 瓶子3： | GOPOD试剂缓冲液。缓冲液（50 mL， |
| pH7.4），对羟基苯甲酸和叠氮化钠 | |
| （0.095%w/v）。 | |
| 在4°C下稳定>4年。 | |
| 瓶子4： | GOPOD试剂酶。葡萄糖氧化酶 |
| 加上过氧化物酶和4-氨基安替比林。冻结- | |
| 干粉。 | |
| 在-10℃以下稳定5年以上。 | |
| 瓶子5： | D-葡萄糖标准溶液（5 mL，1.0 mg/mL）在 |
| 0.2%（w/v）苯甲酸。 | |
| 室温下可稳定5年以上。 | |
| 瓶子6： | 淀粉对照品（规定含量 |
| 直链淀粉）。 | |
| 室温下可稳定5年以上。 |
试剂溶液/悬浮液的制备：
1. 将1号瓶的内容物溶解在50毫升CONA溶剂（缓冲液3，第4页）中。分为适当大小的小份，并在使用之间储存在-10°C以下的聚丙烯管中，如有可能，在使用过程中保持冷却。在-10℃以下稳定2年以上。
2. 将瓶2的内容物溶解在20 mL醋酸钠缓冲液（100 mM，pH 4.5）中。分为适当大小的等分试样，并在使用期间储存在-10°C以下的聚丙烯管中，如有可能，在使用过程中保持冷却。在-10℃以下稳定2年以上。
3. 将瓶3（GOPOD试剂缓冲液）的内容物稀释至此溶液（1）为蒸馏水。立即使用。
注：
1. 储存时，盐晶体可能在浓缩缓冲液中形成。当用蒸馏水将缓冲液稀释至1L时，必须将其完全溶解。
2. 该缓冲液含有0.095%（w/v）叠氮化钠。
这是一种有毒的化学物质，应该进行相应的处理。
4. 用20毫升溶液3溶解4号瓶的内容物，并将其定量转移到含有剩余溶液3的瓶子中。用铝箔盖住这个瓶子，以保护密封的试剂不受光照。这是葡萄糖测定试剂（GOPOD试剂）。在2-5°C或低于-10°C下存放超过12个月，可稳定~3个月。
5号和6号。使用提供的瓶子5和6的内容物。
室温下可稳定5年以上。
| 安全注意事项： 1. 二甲基亚砜（DMSO）被列入默克指数（No。 3255）作为皮肤刺激物，因此应谨慎使用。它通过皮肤吸收，会对皮肤和眼睛造成刺激。穿戴PPE，避免溶剂飞溅。尽可能在通风橱中使用。 2. 刀豆蛋白A通过吸入、皮肤接触和摄入有害。影响可能是不可逆的，可能涉及致畸。处理结晶CONA时穿戴适当的PPE，处理含有CONA的溶液时戴手套。 3. 叠氮化钠是一种有毒化学物质，应进行相应处理。它只是作为防腐剂添加到缓冲液中的。可以从缓冲配方中删除，但缓冲液应储存在4°C。 |
缓冲液和溶剂（未提供）：
1 乙酸钠缓冲液（100 mM，pH 4.5）
向900 mL蒸馏水中添加5.9 mL冰醋酸（1.05 g/mL）。通过添加1 M（4 g/100 mL）氢氧化钠溶液（需要大约30 mL），将pH值调节至pH 4.5。加入0.2g叠氮化钠，调节体积至1L，室温下稳定2年以上。
2 浓缩ConA溶剂（600 mM，pH 6.4醋酸钠缓冲液）
溶解49.2 g无水乙酸钠（Sigma cat。不。
71183），175.5 g氯化钠（Sigma cat。编号：S7653），
0.5 g CaCl.2HO（Sigma cat。编号C5080），0.7 g MgCl.6HO（Sigma cat。编号M2670）和0.7 g MnCl.4HO（Sigma cat。在900毫升蒸馏水中。逐滴加入冰醋酸，调节pH至6.4，然后用蒸馏水将体积调节至1L。在4℃下稳定2周。222222
注：制备此缓冲混合物时，必须非常小心地调整pH值。如果pH值显著低于6.4，则会形成沉淀，并且在pH值调整时不会重新溶解。因此，必须丢弃该缓冲液并制备新的一批。
三。CONA溶剂（工作浓度）
用蒸馏水将30ml浓缩cona溶剂稀释至100ml。准备当天使用。
4 二甲基亚砜
分析试剂等级（BDH Analar cat。编号10323）。室温下稳定5年。
设备（推荐）：
1. 玻璃器皿：
- 容量瓶（25ml）；
- 玻璃试管（16 x 120毫米，15毫升）；
- 螺旋盖样品管（Kimax）（10 mL）。®
2. 微量移液器，用于分配50-1000µL（例如Gilson Piptman）。
3. 容积式移液器，如Eppendorf Multipette。®
4. Eppendorf微型胶管（容量2.0 mL）。®
5. 开水浴。
6. 台式离心机（容量2000g）。
7. 涡流混合器（如IKA Yellowline试管振荡器TTS2）。®
8. 分光光度计（设置为510 nm）。
9. 停车钟。
10. 分析天平。
11. 微型食品（容量14000克）。
12. 恒温水浴器设置为40°C。
注意事项：
淀粉样品必须按照说明用乙醇预处理，以去除脂质。如果样品不经乙醇处理，一些样品中的直链淀粉含量可能会低估50%。
化验程序：
A、 淀粉预处理
1. 准确称取淀粉或面粉样品（20-25毫克精确到0.1毫克）到一个10毫升螺旋盖的Kimax样品管中。记录样品重量，精确至0.1 mg。®
注：每批包括一个参考样品。每五个试样重复一次。
2. 向试管中加入1ml二甲基亚砜，同时在涡流混合器上以低速轻轻搅拌。盖住试管，在沸水浴中加热试管内容物，直到样品完全分散（大约1分钟）。确保没有凝胶状的淀粉块残留。
3. 在涡流混合器上高速强力混合密封管的内容物，将管放入沸水浴中加热15分钟，在涡流混合器上间歇高速搅拌。
4. 将试管在室温下储存约5分钟，并在涡流混合器上连续搅拌，添加2ml 95%（v/v）乙醇。再加4毫升乙醇，盖上试管，倒置搅拌。会形成淀粉沉淀物。让试管静置15分钟（或过夜，如果需要）。
5. 离心试管（2000 g）5分钟，丢弃上清液，并将试管放在纸巾上10分钟。确保已排出所有乙醇。在随后的直链淀粉和淀粉测定中使用颗粒。
6. 向淀粉颗粒中添加2ml二甲基亚砜（用温和的涡流混合）。将试管放在沸水浴中15分钟，偶尔搅拌。确保没有胶状肿块。
7. 从沸水浴中取出试管后，立即添加4 mL Con A溶剂（缓冲液3；第4页），充分混合，然后定量转移试管内容物（用Con A溶剂反复洗涤）至25 mL容量瓶中。用CONA溶剂（这是溶液A）稀释至一定体积。如有必要，用Whatman 1号滤纸过滤此溶液（整个面粉样品需要此步骤）。®
注：该溶液应在2小时内进行分析。
B、 支链淀粉的沉淀与直链淀粉的测定
1. 将1.0 mL溶液A转移到2.0 mL Eppendorf microfuge试管中。添加0.50 mL CONA溶液（瓶1），盖上试管并通过反复倒置轻轻混合。避免样品起泡。®
2. 让试管在室温下静置1小时。在室温下，将14000 g在微型食品中离心10分钟。
注：
1. 不能将CONA溶剂（即上文A节所述的溶液A）中的样品放置较长时间，因为直链淀粉会倾向于逆行和沉淀。
2. 在室温下，支链淀粉的有效cona沉淀（以上步骤B1）所需的时间为1h。
然而，这些溶液不应超过2小时，因为直链淀粉将趋于逆行。
3. 在这个过程中，用乙醇对样品进行预处理有一个额外的优点，即去除样品中可能干扰测定的任何可溶性糖。
3. 将1ml上清液转移至15ml离心管中。添加3 mL 100 mM乙酸钠缓冲液，pH值4.5。这会使pH值降至~5。混合所有成分，轻轻塞上塞子（用大理石），在沸水浴中加热5分钟，使cona变性。
4. 将试管置于40°C的水浴中，使其平衡5分钟。添加0.1 mL淀粉葡萄糖苷酶/α-淀粉酶混合物（第3页；溶液2），并在40°C下培养30分钟。在2000 g下离心试管5分钟。
5. 向1.0 mL上清液的等分试样中添加4 mL GOPOD
试剂（试剂B）。在40°C下培养20分钟。同时培养试剂空白和D-葡萄糖对照品。
注：
通过将1.0 mL 100 mM醋酸钠缓冲液（缓冲液1；第4页）添加到4.0 mL GOPOD试剂中，并在40℃下培养20 min来制备试剂空白。
D-葡萄糖控制（副本）包括0.1 mL D-葡萄糖标准溶液（1 mg/mL）、0.9 mL醋酸钠缓冲液和4.0 mL GOPOD试剂。计算中不使用该值，但我们建议执行该值以确保该部分分析没有问题。
6.在510 nm处，对照试剂空白，读取每个样品和D-葡萄糖对照品的吸光度。
C、 总淀粉的测定
1. 将0.5 mL溶液A与4 mL 100 mM乙酸钠缓冲液（pH值4.5）混合。
2. 添加0.1 mL淀粉葡萄糖苷酶/α-淀粉酶溶液，并在40°C下培养10分钟。
3. 移取1.0 mL等分试样（一式两份）于玻璃试管中，加入4 mL GOPOD试剂（溶液4），混匀。在40°C下培养20分钟。该培养应与上述B节中的样品和标准品同时进行。
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