葡萄糖氧化酶K-GLOX检测试剂盒使用说明书
2025-03-24 来源:本站 点击次数:333
葡萄糖氧化酶K-GLOX
（200 次手动检测/盒）或
（1960 次自动分析仪检测/盒）或
（2000 次微孔板检测/盒）
产品介绍：
葡萄糖氧化酶（GOX）催化β-D-葡萄糖氧化生成 D-葡萄糖酸-δ-内酯和过氧化氢。葡萄糖氧化酶对β-D-葡萄糖具有高度特异性，对α-D-葡萄糖完全没有催化活性。葡萄糖氧化酶的主要用途之一是测定体液、食品和农产品中的游离葡萄糖含量。它也是一种常用烘焙添加剂，用于增加面筋强度。在一些应用中也可用于替代传统的氧化剂，例如溴酸盐和 L-抗坏血酸。葡萄糖氧化酶的其他用途包括去除食品包装袋内的氧气和去除蛋清中的 D-葡萄糖以防止发生褐变反应。
原理：
葡萄糖氧化酶催化 β-D-葡萄糖氧化生成 D-葡萄糖酸-δ-内酯，并释放过氧化氢（H2O2）（1）。在过氧化物酶（POD）的作用下，过氧化氢与对羟基苯甲酸和 4-氨基安替比林反应，定量生成醌亚胺染料。测定醌亚胺染料在 510 nm 波长下的吸光度值（2）。
检测涉及的反应如下：
试剂盒：
试剂盒：
纽勤提供可进行 200 次手动检测（或 1960 次自动分析仪检测或 2000 次微孔板检测）的试剂盒。该试剂盒包含完整的检测方法以及：
1 号瓶：（x2）
缓冲液（12 mL，pH 7.0），含对羟基苯甲酸与防腐剂叠氮化钠（0.09% w/v）。
置于 4 ℃下保存。有效期限请查看单独的试剂瓶标签。
2 号瓶：（x2）
过氧化物酶，4-氨基安替比林和稳定剂；冻干粉。
置于-10 ℃以下保存。有效期限请查看单独的试剂瓶标签。
3 号瓶：
D-葡萄糖（约 10 g）。
D-葡萄糖（约 10 g）。
室温密封保存。有效期限请查看单独的试剂瓶标签。
4 号瓶：
葡萄糖氧化酶标准品（约 2.9 U；实际酶活力值请查看试剂瓶标签）。
置于-10 ℃以下保存。有效期限请查看单独的试剂瓶标签。
5 号瓶：
缓冲液（5 mL，pH 7.0），BSA（0.5 % w/v）和防腐剂叠氮化钠（0.04% w/v）。
置于 4 ℃下保存。有效期限请查看单独的试剂瓶标签。
试剂溶液制备：
1. 用蒸馏水将其中一个 1 号瓶内容物稀释至近 150 mL，得到溶液 1。现配现用。需要时再稀释第二个 1 号瓶的内容物。
2. 将其中一个 2 号瓶的内容物溶解于溶液 1 中。检查 pH 值，如有必要，用 1 M 盐酸（HCl）或 1 M 氢氧化钠（NaOH）调节 pH 至 7.0。定容至 200 mL，得到溶液 2（POD 混合溶液）。
在 4 ℃下可稳定 1 个月以上，在-10 °C 以下可稳定 12 个月以上。
如需冷冻保存，应将试剂分装在聚丙烯容器中保存。不可反复冻融。
3. 称取 4.5 g 3 号瓶内容物（D-葡萄糖），溶解于 40 mL 蒸馏水中。定容至 50 mL，得到溶液 3（D-葡萄糖）。
在-10 ℃以下可稳定 12 个月以上。
4.& 5. 用蒸馏水将 5 号瓶内容物稀释至近 40 mL，得到溶液 4。用约 3 mL溶液 4 溶解 4 号瓶内容物。将溶液定量转移至一个 50 mL 的容量瓶中。再用约 5 mL 溶液 4 冲洗 4 号瓶，将剩余内容物转移至容量瓶中。将剩余溶液 4 倒入容量瓶中，用蒸馏水定容至 50 mL。将溶液分装成10 mL 小份储存在聚丙烯容器中，得到溶液 5（葡萄糖氧化酶标准溶液）。
在-10 °C 以下可稳定 2 年以上。
注意：
只有在怀疑检测使用的分光光度计的准确性，或者怀疑样品中的某些物质具有抑制作用时，才在手动检测程序（A）中对葡萄糖氧化酶标准溶液（溶液 5）进行测定。检测程序 B 或 C 必须使用溶液 5。
提取/稀释缓冲液（缓冲液 A）：
注意：
只有在怀疑检测使用的分光光度计的准确性，或者怀疑样品中的某些物质具有抑制作用时，才在手动检测程序（A）中对葡萄糖氧化酶标准溶液（溶液 5）进行测定。检测程序 B 或 C 必须使用溶液 5。
提取/稀释缓冲液（缓冲液 A）：
0.1 M 磷酸钾缓冲液（pH 7.0），含 0.5 mg/mL BSA 和防腐剂 0.02%（w/v）叠氮化钠。
向 800 mL 蒸馏水中加入 13.6 g 磷酸二氢钾（MW=136.1），用 2 M 氢氧化钠调节pH 至 7.0。定容至 1 L。加入 0.5 g BSA（Sigma 货号 A2153）和 0.2 g 叠氮化钠（Sigma 货号 S2002）并溶解，得到缓冲液 A。
设备（推荐）：
设备（推荐）：
1. 容量瓶（50 mL 和 100 mL）。
2. 一次性塑料比色皿（光径 1 cm，容量 3.0 mL）。
3. 微量移液器，例如 Gilson Pipetman®（1000 μL）。
4. 正位移移液器，例如 Eppendorf Multipette®，带 25 mL Combitip®移液管[移取0.5 mL 溶液 3（D-葡萄糖）和 2.0 mL 溶液 2（POD 混合溶液）]。
5. 分析天平。
6. 记录式分光光度计，波长设置为 510 nm，温度设置为 25±0.1 °C。
7. 旋涡混合器（如 IKA® Yellowline 试管振荡器 TTS2）。
样品制备示例：
测定酶制剂中的葡萄糖氧化酶。准确称取约 100 mg 葡萄糖氧化酶制剂置于一个100 mL 的烧杯中。加入 50.0 mL 提取/稀释缓冲液（缓冲液 A），在磁力搅拌器上轻轻搅拌，直至完全溶解。取 1.00 mL 溶液转移至一个 100 mL 的容量瓶中进行稀释，用缓冲液 A 定容至刻度线。倒置混合均匀，并根据需要进行进一步稀释，以获得适合检测的酶浓度（0.01-0.08 U/mL）。
A.手动检测程序：
波长：510 nm
比色皿：1 cm 光径（玻璃或塑料材质）
温度：25 ± 0.1 °C
最终体积：3.0 mL
样品溶液：葡萄糖氧化酶稀释至 0.01-0.08 U/mL
以空气（光路中不放置比色皿）或蒸馏水为空白
计算：
注意：可以使用 Mega-CalcTM来简化这些计算。
测定空白和样品的吸光度差值（A2-A1）。从样品吸光度差值中减去空白吸光度差值，得到样品的 20 分钟∆A510 nm。尽管用葡萄糖氧化酶孵育后的吸光度增加值与孵育时间呈线性关系（图 1，第 6 页），葡萄糖氧化酶活力值（mU/检测溶液，即/0.5 mL）与孵育 20 分钟后在 510 nm 波长下测得的吸光度增加值的标准曲线并不具有完美的线性关系（图 2，第 7 页）。参照图 2 中的标准曲线，得出酶活力值（mU/0.5 mL），计算方法如下：
U/L 样品溶液 = mU/0.5 mL× 2000 ×1/1000× D
= mU/0.5 mL × 2 × D
式中：
参照标准曲线（图 2，第 7 页），得出 20 分钟∆A510 nm 对应的 mU/0.5 mL。
2000 =1 L 至 0.5 mL 的转换系数
1/1000 =mU 至 U 的转换系数
D =稀释倍数（即，如果将样品稀释 10 倍，则 D=10）
对于固体和半固体样品，在样品制备过程中称量其质量，并按以下公式计算称重样品的酶活力（U/g）：
葡萄糖氧化酶活力（U/g 制剂）
= GOX 活力 [U/L 样品溶液]/质量样品[g/L 样品溶液]
图 1：检测混合物中不同葡萄糖氧化酶浓度的反应曲线的线性关系。A. 0 mU；B. 10 mU；C. 20 mU；D. 30 mU；E. 40 mU。
mUnits/0.5 mL=（15.4 × Abs2）+（44.7 × Abs）+0.03
图 2：葡萄糖氧化酶活力（mU/检测溶液，即/0.5 mL）与 510 nm 波长下吸光度值的标准曲线。
B.自动分析仪检测程序：
注意：
1. 葡萄糖氧化酶自动分析仪检测程序可使用单点标准法或完整校准曲线进行。
2. 对于用于葡萄糖氧化酶测定的每批样品，必须使用同一批试剂进行单点校正
或绘制校准曲线。
试剂制备步骤如下：
制备 R1：
方法示例：
R1：0.250 mL
样品：0.050 mL
反应时间：25 ℃下反应 20 分钟
波长：510 nm
制备试剂的稳定性：冷藏可稳定 2 天以上
计算：动力学计算
反应方向：增加
线性度：0.01-0.08 U/mL 葡萄糖氧化酶，样品体积为 0.01 mL
C.微孔板检测程序：
注意：
1. 葡萄糖氧化酶微孔板检测程序可使用单点标准法或完整校准曲线进行。
2. 对于用于葡萄糖氧化酶测定的每批样品，必须使用同一批试剂进行单点校正或绘制校准曲线。
波长：510 nm
微孔板：96 孔（透明平底，玻璃或塑料材质）
温度：25 °C
最终体积：0.300 mL
线性度：每孔 0.01-0.08 U/mL 葡萄糖氧化酶（样品体积为 0.05 mL）
计算（微孔板检测程序）：
测定空白样、样品和校准曲线标准品（或单点法标准品）的吸光度差值（A2-A1）。从样品和标准品吸光度差值中减去空白样吸光度差值，得到 20 分钟∆A510 nm。直接交叉参照 20 分钟∆A510 nm 与葡萄糖氧化酶活力校准曲线，得到检样的葡萄糖氧化酶活力值。
或者：
如果在样品制备过程中对样品进行稀释处理，则必须将结果乘以稀释倍数，D。
相关文章
更多 >