果聚糖测定方案K-FRUC(含重组菊粉酶和左旋糖酶)使用说明书
2025-03-31 来源:本站 点击次数:288
果聚糖测定方案K-FRUC(含重组菊粉酶和左旋糖酶)
每个试剂盒100次检测
AOAC方法
999.03AACC方法
32-32.01法典II类方法
简介:
果聚糖被定义为一个或多个果糖基-果糖键构成大部分键的任何化合物1。这是指聚台物材料以及与二糖,菊粉糖一样小的低聚物。该定义中包含的材料可能包含也可能不包含D-葡萄糖基取代基。果聚糖研究人员使用术语低聚物和聚合物来区分可以特定表征的材料和不能表征的材料1。果聚糖在植物界广泛分布。它们存在于单子叶物，双子叶植物和绿藻中果聚糖的分子结构和分子量不同。它们可分为三种主要类型:菊粉基团,果聚糖基团和分支基团。菊粉组由主要或完全具有(2→1)果糖基果糖键。Levan是一种主要或完全含有(2→6)果糖基果糖键。支链基团具有大量的（2→1）和（2→6）果糖基-果糖键（例如来自禾本科的禾本素）。
已经描述了几种用于测量植物材料和食品中果聚糖的方法,但通常认为它们最好在水解成D-果糖和D-葡萄糖后测量。这引入了独立去除或测量蔗糖,D-果糖和D-葡萄糖的挑战。Pontis(1966)2用结晶酵母转化酶水解蔗糖,并通过用氢氧化钠煮沸破坏所得的D-葡萄糖和D-果糖以及现有的单糖。然而,酵母转化酶也水解较低聚合度(DP)的低聚果糖(FOS )。浓度为10 mg/mL时 ,1-酮糖的水解率约为蔗糖的20% ,1,1-酮四糖的水解率约为蔗糖的10%。3
在McCleary和Blakeney(1999)引入的果聚糖测定程序中,样品中的蔗糖用特定的蔗糖酶水解,释放的D-葡萄糖和D-果糖以及样品中的所有其他还原糖通过硼氢化物还原成相应的糖醇(不用PAHBAH试剂测量)。然后用高度纯化的内菊粉酶和外菊粉酶菊型和支链型果聚糖水解成D-葡萄糖和D-果糖。随后,重组产生超纯的外切和内切菊粉酸并将其引入该方法。这些酶的使用消除了痕量B-葡萄糖苷酶和非重组酶中存在的B-葡糖寡糖部分水解的问题。在最近的发展中,重组内切果聚糖酶已被掺入果聚糖酶混合物中,将该方法的使用扩展到测量草中存在的果聚糖型果聚糖,如蒂莫西,鸡冠,黑麦草和红羊茅。在没有内切果聚糖酶的情况下,果聚糖型果聚糖被低估了(表1)4，5
本手册中描述的方法采用超纯重组酶，专门测量菊苣、大丽花、菊芋中的菊粉型果聚糖等果聚糖；洋葱和小麦茎叶中高度分枝的果聚糖；以及来自帝汶草等牧草的levan型果聚糖。这种方法低估了商业上部分水解的果聚糖产品，如Raftilose P-95®（约20%），其程度与果聚糖的水解程度有关。如果果聚糖/FOS成分的样本可用，则很容易通过分析确定实际低估的程度（见附录A）。龙舌兰果聚糖是定量测量的。商业龙舌兰果聚糖制剂含有高达20%的果糖、葡萄糖和蔗糖（蔗糖不是果聚糖，因此未被测量）。
原理：
蔗糖被一种特定的蔗糖酶水解，这种酶对低聚合度（DP）的FOS（如1-果糖和1,1-酮四糖）没有作用3。淀粉和麦芽糊精被普鲁兰酶和β-淀粉酶水解为麦芽糖和麦芽三糖，然后这些低聚糖被麦芽糖酶水解为D-葡萄糖（1&2）。由于蔗糖酶在30°C下更稳定，因此现在这是该培养步骤的推荐温度。
D-葡萄糖和D-果糖被硼氢化钠还原为相应的糖醇、D-山梨醇和D-甘露醇。在这个反应中，水解菊粉制剂中低聚果糖还原端的D-果糖基残留物也被还原为糖醇。天然果聚糖和非还原性FOS，如Neosugs®，不受此反应的影响（3）。
FOS、果聚糖和硼氢化物还原的FOS被内切和内切菊粉酶和内切左旋酶特异性水解为D-葡萄糖和D-果糖（4）。
使用PAHBAH还原糖法测量来自果聚糖的D-果糖和D-葡萄糖。6这种方法使用简单，D-果糖和D-葡萄糖的颜色响应相同（5）。
特异性、敏感性、线性和精密度：
该测定是在AOAC International和AACC International的主持下成功进行的实验室间评估的主题。7该测定对所有类型的果聚糖都有特异性，包括：；主要或仅含有（2→1）果糖基-果糖键（菊粉）的那些；具有大量（2→1）和（2→6）果糖基-果糖键的那些（例如来自洋葱、禾本科和龙舌兰的那些）；以及主要或仅含有（2-6）果糖基-果糖键（levan）的那些。硼氢化物还原的FOS被水解，从“还原端”末端释放出D-甘露醇。谷物中果聚糖的微量水平可以通过混合连接β-葡聚糖的部分水解来测量，而不会降低糖水平。如果样品可能含有半乳糖基蔗糖低聚糖（如棉子糖），应通过α-半乳糖苷酶水解将其去除。
该测定的最小区分吸光度为0.010吸光度单位。这相当于被分析样品提取物中12.8μg/mL的D-葡萄糖和D-果糖。
检测限为每毫升样品提取物25.6μg D-果糖和/或D-葡萄糖，这是由0.02的测定吸光度差得出的。
该测定在每次测定2.3至55μg D-果糖或D-葡萄糖的范围内呈线性。在使用一种样品溶液进行两次测定时，可能会出现0.005至0.010的吸光度差，这对应于每次测定的D-果糖或D-葡萄糖水平为0.023-0.046μg。
干扰：
被分析样品中的干扰物质可以通过加入菊粉或左旋内标来识别。预计该标准的定量回收。样品处理和提取过程中的损失是通过进行回收实验来识别的，即在初始提取步骤中向样品中添加菊粉或果聚糖。
安全：用于测定果聚糖的试剂不是《危险物质条例》意义上的危险物质。应遵守适用于化学物质的一般安全措施。
套件内容：
Megazyme提供适用于进行100次检测的试剂盒。试剂盒包含完整的检测方法以及：
瓶子1. 蔗糖酶加β-淀粉酶、普鲁兰酶和麦芽糖酶冻干粉。储存温度低于-10°C。有效期见单独标签。
瓶子2. 果糖酶。冻干粉状重组外旋和内切菊粉酶以及重组内切（x2）左旋酯酶。储存温度低于-10°C。有效期见单独标签。
瓶子3. 菊粉控制面粉。菊粉在α-纤维素存在下冷冻干燥。在室温下储存。有效期见单独标签。
瓶子4. Levan控制面粉。提摩太草在α-纤维素存在下冻干。在室温下储存。有效期见单独标签。
瓶子5. 蔗糖控制面粉。蔗糖在α-纤维素存在下冷冻干燥。在室温下储存。有效期见单独标签。
瓶子6. D-果糖标准溶液（1.5 mg/mL）在0.2%（w/v）苯甲酸中的溶液。在室温下储存。有效期见单独标签。
酶的制备：
1.将瓶子1的内容物（蔗糖酶和β-淀粉酶等）溶解在22 mL缓冲液1中[马来酸钠（100 mM，pH 6.5加牛血清白蛋白（0.5 mg/mL）]（酶溶液A）。分成适当体积的等分试样，储存在聚丙烯管中。
在-10°C以下稳定≤2年。
2. 将瓶子2（果糖酶）中的一个内容物溶解在11 mL缓冲液2[乙酸钠（100 mM，pH 4.5）]中。这是酶溶液B。分成适当体积的等分试样，储存在聚丙烯管中。在-10°C以下稳定4个月。在需要之前，不要溶解剩余的瓶子2（果聚糖酶）。
注意：重新悬浮瓶子2（果糖酶）所需的体积与AOAC方法（999.032016.142018.07）中所述的体积不同，但所得酶溶液B的浓度保持不变。因此，它可以在这些方法的其余步骤中正常使用。
3、4、5使用提供的瓶子3、4，5和6中的内容物。
&6在室温下稳定>5年。
缓冲液（未提供）：
缓冲液1：马来酸钠缓冲液（100 mM，pH 6.5）
将马来酸（11.6 g，Sigma目录号M0375）溶解在900 mL蒸馏水中，用氢氧化钠溶液（2 M）将pH值调节至6.5。将音量调节到1升。
向100 mL该缓冲液中加入50 mg牛血清白蛋白，使浓度达到0.5 mg/mL。该缓冲液用于溶解瓶子1（蔗糖酶制剂）。缓冲液应存放在-10°C以下。
缓冲液2：醋酸钠缓冲液（100 mM，pH 4.5）
将冰醋酸（5.8 mL）加入900 mL蒸馏水中。使用1M氢氧化钠将pH值调节至4.5。将音量调节到1升。这是缓冲液2。
试剂（未提供）：
1.PAHBAH还原糖测定试剂
溶液A.在磁力搅拌器上的250毫升烧杯中，将10克对羟基苯甲酸酰肼（Sigma目录号H9882-100G）（PAHBAH）加入60毫升蒸馏水中。搅拌浆液，加入10mL浓盐酸。用蒸馏水将溶液的体积调节至200毫升。
溶液B.将24.9 g柠檬酸三钠二水合物（MW=294.1）加入500 mL蒸馏水中并搅拌溶解。加入2.2克二水合氯化钙（分子量=147.01）并溶解。加入40.0克氢氧化钠，搅拌溶解（溶液可能呈乳白色，但稀释至2升后会澄清）。将音量调节到2升。
PAHBAH工作试剂。使用前，将20 mL溶液A加入180 mL溶液B中，并充分混合。混合溶液在冰上稳定约4小时。
2.氢氧化钠（50 mM）
将2.0克氢氧化钠溶解在900毫升蒸馏水中。将音量调节到1升。
3.碱性硼氢化物（在50mM氢氧化钠中的10mg/mL硼氢化钠）
精确称取约50mg硼氢化钠（Sigma目录号213462-100G），放入聚丙烯容器（容量10mL，带螺帽）中。记录试管上的确切重量（为方便起见，约为10），密封试管并将其储存在干燥器中以备将来使用。在室温下稳定2年以上。
使用前，将硼氢化钠（10mg/mL）溶解在50mM氢氧化钠中。该溶液在室温下稳定4-5小时。这是试剂3（碱性硼氢化物溶液）。
4.乙酸（200 mM）
将11.6 mL冰醋酸加入600 mL蒸馏水中，并将体积调节至1 L。这是试剂4（200 mM醋酸）。
设备（推荐）：
1.玻璃试管（圆底；16 x 100 mm）。
2.带PTFE内衬酚醛盖的Pyrex螺旋盖培养管（25 x 150 mm）（Fisher目录号14-933D）。
3.微量移液器，例如Gilson Pipetman®（100μL和200μL）。
4.正排量移液器，例如Eppendorf Multipete®
-使用5.0 mL Combitip®（分配0.2 mL等分蔗糖酶混合物和0.1 mL等分果糖，以及其他溶液和缓冲液）。
-使用50 mL Combitip®（分配5.0 mL PAHBAH工作试剂等分试样）。
5.Brand®Dispensette®S数字瓶盖分配器（2.5-25mL）（Sigma目录号BR4600351）。
-分配10mL 200mM乙酸钠缓冲液（pH 5.0）。
6.分析天平。
7.分光光度计设置为410 nm。
8.涡流混合器（例如Vortex Genie®2混合器）。
9.恒温水浴（设置为30°C和40°C）。
10.沸水浴。
11.微型离心机（所需转速13000 rpm）。
12.一次性1.5毫升聚丙烯微量离心管，如Sarstedt Cat No.72.690（www.sarstedt.com）。
13.计数器。
控制和预防措施：
1.使用PAHBAH试剂在100°C下孵育的时间至关重要，应使用秒表计时。
2.在每组测定中，应同时包括试剂空白和D-果糖对照并进行分析。
a） 试剂空白由0.3 mL 100 mM醋酸钠缓冲液（缓冲液2）和5.0 mL PAHBAH工作试剂组成。
b） 通过将0.2 mL D-果糖标准溶液（1.5 mg/mL）加入0.9 mL 100 mM乙酸钠（pH 4.5）（缓冲液2）中并充分混合来制备D-果糖对照品。将0.2 mL等分的该溶液（含54.5μg D-果糖）分为四份，放入玻璃试管（16 x 100 mm）中。向每个试管中加入0.1 mL缓冲液2和5.0 mL PAHBAH工作试剂（在沸水浴中孵育之前）。
3.每组测定都包括菊粉/纤维素对照粉末和/或果聚糖/纤维素对照粉。药瓶标签上标明了这些粉末的果聚糖含量。
4.每批新试剂都应分析蔗糖/纤维素对照粉末。如果蔗糖酶处理步骤完全有效，则测定的果聚糖值应为约0.2%（w/w）。如果蔗糖酶无效，测定值将反映对照蔗糖/纤维素粉末的蔗糖含量[约10%（w/w）；见小瓶标签]。
5.D-果糖对照品（一式四份）和试剂空白溶液（一式两份）与每批样品一起运行，并与样品同时在沸水浴中孵育。
6.可以使用D-果糖标准溶液（0.2 mL，1.5 mg/mL）并从测定程序的步骤B.1（第8页）开始检查硼氢化物还原的有效性。用果聚糖酶处理（步骤C.2）改为加入醋酸盐缓冲液（0.1 mL，0.1 M，pH 4.5）。用PAHBAH工作试剂孵育后，溶液应无色。
7.如果被分析的样品含有半乳糖基蔗糖低聚糖，可以通过与黑曲霉α-半乳糖苷酶（Megazyme cat.no.E AGLANP）孵育将其去除。请参阅Megazyme网站上K-FRUC下的常见问题（FAQ）。
测定程序：
将干燥样品研磨以通过0.5毫米的筛网。用锋利的刀将固体脂肪样品（如巧克力）切成细小的刨花；软食品（如涂抹食品）无需进一步准备即可进行分析。所有样品在称重前应在室温下进行。
A.果聚糖提取
含有0-10%（w/w）果聚糖的样品
准确称取约400mg样品放入干燥的pyrex螺旋盖培养管（25 x 150 mm）中，并加入25 mL蒸馏水。松松地盖住管子。将试管放入沸水浴中加热10分钟。5分钟后，拧紧管帽，通过倒置和摇晃试管剧烈混合内容物。将试管放回沸水浴中。再过5分钟后，将试管从沸水浴中取出，通过倒置和摇动再次混合内容物。
含有10-40%（w/w）果聚糖的样品
准确称取约100mg样品，放入干燥的pyrex螺旋盖培养基中 试管（25 x 150 mm）并加入25 mL蒸馏水。松松地盖住管子。放置 将试管放入沸水浴中加热10分钟。5分钟后，拧紧 盖上管帽，通过倒置和摇晃剧烈混合内容物。放回试管 放入沸水浴中。再过5分钟后，将试管从沸腾中取出 水浴，通过倒置和摇动再次混合内容物。在每种情况下，让试管内容物冷却至室温，然后转移~ 2.0 mL放入2.0 mL微量离心管中，以13000 rpm离心5分钟。
注意：对于含有40-100%（w/w）果聚糖的样品，加入1 mL离心提取物 加入2mL水中并进行测定。
B. 去除蔗糖、淀粉和还原糖：
注意：如果样品中蔗糖和麦芽糊精含量很高（例如婴儿 牛奶配方），将孵化时间延长至60分钟，以确保完全 这些低聚糖的水解。 在每种情况下，让试管内容物冷却至室温，然后转移~ 2.0 mL放入2.0 mL微量离心管中，以13000 rpm离心5分钟。
3.向试管中加入0.2 mL试剂3（碱性硼氢化物溶液），剧烈搅拌 并用Parafilm®覆盖管子。将试管在40°C下孵育30分钟以达到效果 将还原糖完全还原为糖醇。
4.在试管中加入0.5mL试剂4（200mM乙酸），并在搅拌下剧烈搅拌 涡流混合器。应观察到强烈的泡腾（这种治疗可以消除 过量硼氢化物并将pH值调节至约4.5）。这被称为解决方案S。
C.果聚糖的水解和测定：
1.准确小心地将0.2 mL等分溶液S转移到3个玻璃杯的底部 试管（16 x 100毫米）。
2.向其中2个试管中加入0.1mL果糖溶液（酶溶液B） （样品）和0.1mL缓冲液2（100mM乙酸钠）至第三个（样品） 空白）。
3.将试管在40°C下孵育30分钟，使果聚糖完全水解为D-果糖和D-葡萄糖。在培养过程中用Parafilm®密封试管。
4.向所有试管中加入5.0 mL PAHBAH工作试剂[样品、样品空白、D-果糖标准品（见对照和注意事项2.b）、试剂空白（对照和 注意事项2.a）和菊粉/纤维素对照提取物和/或果聚糖/ 纤维素控制]并在沸水浴中孵育6分钟。
5.从沸水浴中取出管子，立即将其放入冷水中 将水（18-20°C）加热约5分钟。
6.测量所有溶液在410nm处相对于试剂空白的吸光度。 冷却试管后尽快测量吸光度值。PAHBAH 颜色复合体会随着时间的推移而褪色。
计算：
果聚糖（%w/w）：
其中：
ΔA=样品吸光度-样品空白吸光度（两者均与试剂空白相对）
F=将吸光度值转换为μg D-果糖的系数
=（54.5μg D-果糖）/（54.5微克D-果糖的吸光度）
5=从测定的0.2 mL转换为1.0 mL的系数
25=所用萃取剂的体积（mL）
1.1/0.2=从1.1mL酶消化液中取出0.2mL用于分析
W=提取样品的重量（mg）（即100或200mg）
100/W=表示果聚糖占样品重量百分比的系数
1/1000=从μg转换为mg的系数
162/180=从游离D-果糖转化为果糖酐（和葡萄糖酐）的因子，如
D=样品提取物的进一步稀释
注意：使用Megazyme Mega-Calc™可以简化这些计算， 可从Megazyme网站上的产品显示处下载 （www.megazyme.com）。
表1.用外加内切菊粉酶测定各种样品的果聚糖含量 并且不添加内切左旋酯酶。
附录：
A. 确定由于以下原因而低估果聚糖含量的程度 水解菊粉的硼氢化物还原：
玻璃试管（16 x 120 mm），加入0.9 mL pH 4.5的100 mm醋酸钠缓冲液（缓冲液2）在剧烈搅拌下加入试管中。
6.准确小心地将0.2 mL等分溶液转移到
三个玻璃试管（16 x 100 mm），按照以下步骤进行果聚糖水解标准果聚糖程序；步骤C.2至C.6。这给了非硼氢化物还原的果聚糖样品（NBRF）的吸光度。按照以下计算硼氢化物还原后标准程序中果聚糖的回收率百分比如下：
回收率=吸光度BRF/吸光度NBRF x 100
参考文献：
1. Lewis, D. H. (1993).低聚果聚糖的命名和图示-供讨论的论文。新植物学家， 124, 583-595.
2. Pontis, H. G. (1966). Observations on the de novo synthesis of fructosans
in vivo. Arch Biochem Biochem., 116, 416-423.
3. McCleary, B. V. & Blakeney, A. B. (1999).体内果糖从头合成的观察。 Cereal Foods World, 44, 398-406.
4. Longland, A. C., Dhanoa, M. S. & Harris, P. A. (2011). 比色法和高效液相色谱法测定马牧草中果聚糖的比较。 J. Sci. Food Agric, 92, 1878-1885.
5. McCleary, B. V., Charmier, L., McKie,V. A. & Rogowski, A. (2019). 动物食品（动物饲料、宠物食品和配料）中果聚糖（菊粉、FOS、Levan和支链果聚糖）的测定：单一实验室验证， First Action 2018.07. J. AOAC International, 102(3), 883-892.
6. Lever, M. (1973). 对羟基苯甲酸酰肼比色荧光法测定碳水化合物。 Biochem. Med. 7(2), 274-281.
7. McCleary, B. V, Murphy, A. & Mugford, D. C. (1997). 酶/分光光度法测定食品中的低聚果糖和果聚糖多糖：合作研究。 J. AOAC International, 83, 356-364.
每个试剂盒100次检测
AOAC方法
999.03AACC方法
32-32.01法典II类方法
简介:
果聚糖被定义为一个或多个果糖基-果糖键构成大部分键的任何化合物1。这是指聚台物材料以及与二糖,菊粉糖一样小的低聚物。该定义中包含的材料可能包含也可能不包含D-葡萄糖基取代基。果聚糖研究人员使用术语低聚物和聚合物来区分可以特定表征的材料和不能表征的材料1。果聚糖在植物界广泛分布。它们存在于单子叶物，双子叶植物和绿藻中果聚糖的分子结构和分子量不同。它们可分为三种主要类型:菊粉基团,果聚糖基团和分支基团。菊粉组由主要或完全具有(2→1)果糖基果糖键。Levan是一种主要或完全含有(2→6)果糖基果糖键。支链基团具有大量的（2→1）和（2→6）果糖基-果糖键（例如来自禾本科的禾本素）。
已经描述了几种用于测量植物材料和食品中果聚糖的方法,但通常认为它们最好在水解成D-果糖和D-葡萄糖后测量。这引入了独立去除或测量蔗糖,D-果糖和D-葡萄糖的挑战。Pontis(1966)2用结晶酵母转化酶水解蔗糖,并通过用氢氧化钠煮沸破坏所得的D-葡萄糖和D-果糖以及现有的单糖。然而,酵母转化酶也水解较低聚合度(DP)的低聚果糖(FOS )。浓度为10 mg/mL时 ,1-酮糖的水解率约为蔗糖的20% ,1,1-酮四糖的水解率约为蔗糖的10%。3
在McCleary和Blakeney(1999)引入的果聚糖测定程序中,样品中的蔗糖用特定的蔗糖酶水解,释放的D-葡萄糖和D-果糖以及样品中的所有其他还原糖通过硼氢化物还原成相应的糖醇(不用PAHBAH试剂测量)。然后用高度纯化的内菊粉酶和外菊粉酶菊型和支链型果聚糖水解成D-葡萄糖和D-果糖。随后,重组产生超纯的外切和内切菊粉酸并将其引入该方法。这些酶的使用消除了痕量B-葡萄糖苷酶和非重组酶中存在的B-葡糖寡糖部分水解的问题。在最近的发展中,重组内切果聚糖酶已被掺入果聚糖酶混合物中,将该方法的使用扩展到测量草中存在的果聚糖型果聚糖,如蒂莫西,鸡冠,黑麦草和红羊茅。在没有内切果聚糖酶的情况下,果聚糖型果聚糖被低估了(表1)4，5
本手册中描述的方法采用超纯重组酶，专门测量菊苣、大丽花、菊芋中的菊粉型果聚糖等果聚糖；洋葱和小麦茎叶中高度分枝的果聚糖；以及来自帝汶草等牧草的levan型果聚糖。这种方法低估了商业上部分水解的果聚糖产品，如Raftilose P-95®（约20%），其程度与果聚糖的水解程度有关。如果果聚糖/FOS成分的样本可用，则很容易通过分析确定实际低估的程度（见附录A）。龙舌兰果聚糖是定量测量的。商业龙舌兰果聚糖制剂含有高达20%的果糖、葡萄糖和蔗糖（蔗糖不是果聚糖，因此未被测量）。
原理：
蔗糖被一种特定的蔗糖酶水解，这种酶对低聚合度（DP）的FOS（如1-果糖和1,1-酮四糖）没有作用3。淀粉和麦芽糊精被普鲁兰酶和β-淀粉酶水解为麦芽糖和麦芽三糖，然后这些低聚糖被麦芽糖酶水解为D-葡萄糖（1&2）。由于蔗糖酶在30°C下更稳定，因此现在这是该培养步骤的推荐温度。
D-葡萄糖和D-果糖被硼氢化钠还原为相应的糖醇、D-山梨醇和D-甘露醇。在这个反应中，水解菊粉制剂中低聚果糖还原端的D-果糖基残留物也被还原为糖醇。天然果聚糖和非还原性FOS，如Neosugs®，不受此反应的影响（3）。
FOS、果聚糖和硼氢化物还原的FOS被内切和内切菊粉酶和内切左旋酶特异性水解为D-葡萄糖和D-果糖（4）。
使用PAHBAH还原糖法测量来自果聚糖的D-果糖和D-葡萄糖。6这种方法使用简单，D-果糖和D-葡萄糖的颜色响应相同（5）。
特异性、敏感性、线性和精密度：
该测定是在AOAC International和AACC International的主持下成功进行的实验室间评估的主题。7该测定对所有类型的果聚糖都有特异性，包括：；主要或仅含有（2→1）果糖基-果糖键（菊粉）的那些；具有大量（2→1）和（2→6）果糖基-果糖键的那些（例如来自洋葱、禾本科和龙舌兰的那些）；以及主要或仅含有（2-6）果糖基-果糖键（levan）的那些。硼氢化物还原的FOS被水解，从“还原端”末端释放出D-甘露醇。谷物中果聚糖的微量水平可以通过混合连接β-葡聚糖的部分水解来测量，而不会降低糖水平。如果样品可能含有半乳糖基蔗糖低聚糖（如棉子糖），应通过α-半乳糖苷酶水解将其去除。
该测定的最小区分吸光度为0.010吸光度单位。这相当于被分析样品提取物中12.8μg/mL的D-葡萄糖和D-果糖。
检测限为每毫升样品提取物25.6μg D-果糖和/或D-葡萄糖，这是由0.02的测定吸光度差得出的。
该测定在每次测定2.3至55μg D-果糖或D-葡萄糖的范围内呈线性。在使用一种样品溶液进行两次测定时，可能会出现0.005至0.010的吸光度差，这对应于每次测定的D-果糖或D-葡萄糖水平为0.023-0.046μg。
干扰：
被分析样品中的干扰物质可以通过加入菊粉或左旋内标来识别。预计该标准的定量回收。样品处理和提取过程中的损失是通过进行回收实验来识别的，即在初始提取步骤中向样品中添加菊粉或果聚糖。
安全：用于测定果聚糖的试剂不是《危险物质条例》意义上的危险物质。应遵守适用于化学物质的一般安全措施。
套件内容：
Megazyme提供适用于进行100次检测的试剂盒。试剂盒包含完整的检测方法以及：
瓶子1. 蔗糖酶加β-淀粉酶、普鲁兰酶和麦芽糖酶冻干粉。储存温度低于-10°C。有效期见单独标签。
瓶子2. 果糖酶。冻干粉状重组外旋和内切菊粉酶以及重组内切（x2）左旋酯酶。储存温度低于-10°C。有效期见单独标签。
瓶子3. 菊粉控制面粉。菊粉在α-纤维素存在下冷冻干燥。在室温下储存。有效期见单独标签。
瓶子4. Levan控制面粉。提摩太草在α-纤维素存在下冻干。在室温下储存。有效期见单独标签。
瓶子5. 蔗糖控制面粉。蔗糖在α-纤维素存在下冷冻干燥。在室温下储存。有效期见单独标签。
瓶子6. D-果糖标准溶液（1.5 mg/mL）在0.2%（w/v）苯甲酸中的溶液。在室温下储存。有效期见单独标签。
酶的制备：
1.将瓶子1的内容物（蔗糖酶和β-淀粉酶等）溶解在22 mL缓冲液1中[马来酸钠（100 mM，pH 6.5加牛血清白蛋白（0.5 mg/mL）]（酶溶液A）。分成适当体积的等分试样，储存在聚丙烯管中。
在-10°C以下稳定≤2年。
2. 将瓶子2（果糖酶）中的一个内容物溶解在11 mL缓冲液2[乙酸钠（100 mM，pH 4.5）]中。这是酶溶液B。分成适当体积的等分试样，储存在聚丙烯管中。在-10°C以下稳定4个月。在需要之前，不要溶解剩余的瓶子2（果聚糖酶）。
注意：重新悬浮瓶子2（果糖酶）所需的体积与AOAC方法（999.032016.142018.07）中所述的体积不同，但所得酶溶液B的浓度保持不变。因此，它可以在这些方法的其余步骤中正常使用。
3、4、5使用提供的瓶子3、4，5和6中的内容物。
&6在室温下稳定>5年。
缓冲液（未提供）：
缓冲液1：马来酸钠缓冲液（100 mM，pH 6.5）
将马来酸（11.6 g，Sigma目录号M0375）溶解在900 mL蒸馏水中，用氢氧化钠溶液（2 M）将pH值调节至6.5。将音量调节到1升。
向100 mL该缓冲液中加入50 mg牛血清白蛋白，使浓度达到0.5 mg/mL。该缓冲液用于溶解瓶子1（蔗糖酶制剂）。缓冲液应存放在-10°C以下。
缓冲液2：醋酸钠缓冲液（100 mM，pH 4.5）
将冰醋酸（5.8 mL）加入900 mL蒸馏水中。使用1M氢氧化钠将pH值调节至4.5。将音量调节到1升。这是缓冲液2。
试剂（未提供）：
1.PAHBAH还原糖测定试剂
溶液A.在磁力搅拌器上的250毫升烧杯中，将10克对羟基苯甲酸酰肼（Sigma目录号H9882-100G）（PAHBAH）加入60毫升蒸馏水中。搅拌浆液，加入10mL浓盐酸。用蒸馏水将溶液的体积调节至200毫升。
溶液B.将24.9 g柠檬酸三钠二水合物（MW=294.1）加入500 mL蒸馏水中并搅拌溶解。加入2.2克二水合氯化钙（分子量=147.01）并溶解。加入40.0克氢氧化钠，搅拌溶解（溶液可能呈乳白色，但稀释至2升后会澄清）。将音量调节到2升。
PAHBAH工作试剂。使用前，将20 mL溶液A加入180 mL溶液B中，并充分混合。混合溶液在冰上稳定约4小时。
2.氢氧化钠（50 mM）
将2.0克氢氧化钠溶解在900毫升蒸馏水中。将音量调节到1升。
3.碱性硼氢化物（在50mM氢氧化钠中的10mg/mL硼氢化钠）
精确称取约50mg硼氢化钠（Sigma目录号213462-100G），放入聚丙烯容器（容量10mL，带螺帽）中。记录试管上的确切重量（为方便起见，约为10），密封试管并将其储存在干燥器中以备将来使用。在室温下稳定2年以上。
使用前，将硼氢化钠（10mg/mL）溶解在50mM氢氧化钠中。该溶液在室温下稳定4-5小时。这是试剂3（碱性硼氢化物溶液）。
4.乙酸（200 mM）
将11.6 mL冰醋酸加入600 mL蒸馏水中，并将体积调节至1 L。这是试剂4（200 mM醋酸）。
设备（推荐）：
1.玻璃试管（圆底；16 x 100 mm）。
2.带PTFE内衬酚醛盖的Pyrex螺旋盖培养管（25 x 150 mm）（Fisher目录号14-933D）。
3.微量移液器，例如Gilson Pipetman®（100μL和200μL）。
4.正排量移液器，例如Eppendorf Multipete®
-使用5.0 mL Combitip®（分配0.2 mL等分蔗糖酶混合物和0.1 mL等分果糖，以及其他溶液和缓冲液）。
-使用50 mL Combitip®（分配5.0 mL PAHBAH工作试剂等分试样）。
5.Brand®Dispensette®S数字瓶盖分配器（2.5-25mL）（Sigma目录号BR4600351）。
-分配10mL 200mM乙酸钠缓冲液（pH 5.0）。
6.分析天平。
7.分光光度计设置为410 nm。
8.涡流混合器（例如Vortex Genie®2混合器）。
9.恒温水浴（设置为30°C和40°C）。
10.沸水浴。
11.微型离心机（所需转速13000 rpm）。
12.一次性1.5毫升聚丙烯微量离心管，如Sarstedt Cat No.72.690（www.sarstedt.com）。
13.计数器。
控制和预防措施：
1.使用PAHBAH试剂在100°C下孵育的时间至关重要，应使用秒表计时。
2.在每组测定中，应同时包括试剂空白和D-果糖对照并进行分析。
a） 试剂空白由0.3 mL 100 mM醋酸钠缓冲液（缓冲液2）和5.0 mL PAHBAH工作试剂组成。
b） 通过将0.2 mL D-果糖标准溶液（1.5 mg/mL）加入0.9 mL 100 mM乙酸钠（pH 4.5）（缓冲液2）中并充分混合来制备D-果糖对照品。将0.2 mL等分的该溶液（含54.5μg D-果糖）分为四份，放入玻璃试管（16 x 100 mm）中。向每个试管中加入0.1 mL缓冲液2和5.0 mL PAHBAH工作试剂（在沸水浴中孵育之前）。
3.每组测定都包括菊粉/纤维素对照粉末和/或果聚糖/纤维素对照粉。药瓶标签上标明了这些粉末的果聚糖含量。
4.每批新试剂都应分析蔗糖/纤维素对照粉末。如果蔗糖酶处理步骤完全有效，则测定的果聚糖值应为约0.2%（w/w）。如果蔗糖酶无效，测定值将反映对照蔗糖/纤维素粉末的蔗糖含量[约10%（w/w）；见小瓶标签]。
5.D-果糖对照品（一式四份）和试剂空白溶液（一式两份）与每批样品一起运行，并与样品同时在沸水浴中孵育。
6.可以使用D-果糖标准溶液（0.2 mL，1.5 mg/mL）并从测定程序的步骤B.1（第8页）开始检查硼氢化物还原的有效性。用果聚糖酶处理（步骤C.2）改为加入醋酸盐缓冲液（0.1 mL，0.1 M，pH 4.5）。用PAHBAH工作试剂孵育后，溶液应无色。
7.如果被分析的样品含有半乳糖基蔗糖低聚糖，可以通过与黑曲霉α-半乳糖苷酶（Megazyme cat.no.E AGLANP）孵育将其去除。请参阅Megazyme网站上K-FRUC下的常见问题（FAQ）。
测定程序：
将干燥样品研磨以通过0.5毫米的筛网。用锋利的刀将固体脂肪样品（如巧克力）切成细小的刨花；软食品（如涂抹食品）无需进一步准备即可进行分析。所有样品在称重前应在室温下进行。
A.果聚糖提取
含有0-10%（w/w）果聚糖的样品
准确称取约400mg样品放入干燥的pyrex螺旋盖培养管（25 x 150 mm）中，并加入25 mL蒸馏水。松松地盖住管子。将试管放入沸水浴中加热10分钟。5分钟后，拧紧管帽，通过倒置和摇晃试管剧烈混合内容物。将试管放回沸水浴中。再过5分钟后，将试管从沸水浴中取出，通过倒置和摇动再次混合内容物。
含有10-40%（w/w）果聚糖的样品
准确称取约100mg样品，放入干燥的pyrex螺旋盖培养基中 试管（25 x 150 mm）并加入25 mL蒸馏水。松松地盖住管子。放置 将试管放入沸水浴中加热10分钟。5分钟后，拧紧 盖上管帽，通过倒置和摇晃剧烈混合内容物。放回试管 放入沸水浴中。再过5分钟后，将试管从沸腾中取出 水浴，通过倒置和摇动再次混合内容物。在每种情况下，让试管内容物冷却至室温，然后转移~ 2.0 mL放入2.0 mL微量离心管中，以13000 rpm离心5分钟。
注意：对于含有40-100%（w/w）果聚糖的样品，加入1 mL离心提取物 加入2mL水中并进行测定。
B. 去除蔗糖、淀粉和还原糖：
- 精确分配0.2 mL待分析溶液（含 约0.1-1.0 mg/mL果聚糖）放入玻璃试管（16 x 100 mm）底部。
注意：如果样品中蔗糖和麦芽糊精含量很高（例如婴儿 牛奶配方），将孵化时间延长至60分钟，以确保完全 这些低聚糖的水解。 在每种情况下，让试管内容物冷却至室温，然后转移~ 2.0 mL放入2.0 mL微量离心管中，以13000 rpm离心5分钟。
3.向试管中加入0.2 mL试剂3（碱性硼氢化物溶液），剧烈搅拌 并用Parafilm®覆盖管子。将试管在40°C下孵育30分钟以达到效果 将还原糖完全还原为糖醇。
4.在试管中加入0.5mL试剂4（200mM乙酸），并在搅拌下剧烈搅拌 涡流混合器。应观察到强烈的泡腾（这种治疗可以消除 过量硼氢化物并将pH值调节至约4.5）。这被称为解决方案S。
C.果聚糖的水解和测定：
1.准确小心地将0.2 mL等分溶液S转移到3个玻璃杯的底部 试管（16 x 100毫米）。
2.向其中2个试管中加入0.1mL果糖溶液（酶溶液B） （样品）和0.1mL缓冲液2（100mM乙酸钠）至第三个（样品） 空白）。
3.将试管在40°C下孵育30分钟，使果聚糖完全水解为D-果糖和D-葡萄糖。在培养过程中用Parafilm®密封试管。
4.向所有试管中加入5.0 mL PAHBAH工作试剂[样品、样品空白、D-果糖标准品（见对照和注意事项2.b）、试剂空白（对照和 注意事项2.a）和菊粉/纤维素对照提取物和/或果聚糖/ 纤维素控制]并在沸水浴中孵育6分钟。
5.从沸水浴中取出管子，立即将其放入冷水中 将水（18-20°C）加热约5分钟。
6.测量所有溶液在410nm处相对于试剂空白的吸光度。 冷却试管后尽快测量吸光度值。PAHBAH 颜色复合体会随着时间的推移而褪色。
计算：
果聚糖（%w/w）：
其中：ΔA=样品吸光度-样品空白吸光度（两者均与试剂空白相对）
F=将吸光度值转换为μg D-果糖的系数
=（54.5μg D-果糖）/（54.5微克D-果糖的吸光度）
5=从测定的0.2 mL转换为1.0 mL的系数
25=所用萃取剂的体积（mL）
1.1/0.2=从1.1mL酶消化液中取出0.2mL用于分析
W=提取样品的重量（mg）（即100或200mg）
100/W=表示果聚糖占样品重量百分比的系数
1/1000=从μg转换为mg的系数
162/180=从游离D-果糖转化为果糖酐（和葡萄糖酐）的因子，如
D=样品提取物的进一步稀释
注意：使用Megazyme Mega-Calc™可以简化这些计算， 可从Megazyme网站上的产品显示处下载 （www.megazyme.com）。
表1.用外加内切菊粉酶测定各种样品的果聚糖含量 并且不添加内切左旋酯酶。
| 果聚糖含量，％ W/W（以干物质为基准） | ||
| 样本 | 外消旋酶和内消旋酶 | 外消旋和内消旋异麦芽糖酶加内消旋麦芽糖酶 |
| 猫尾草（样本A） | 4.9 | 13.8 |
| 猫尾草（样本B） | 3.2 | 6.2 |
| 黑麦草 | 8.9 | 9.9 |
| 燕麦干草 | 10.7 | 10.9 |
| 大麦MAX（谷物） | 12.8 | 12.8 |
| 来自猫尾草的纯果聚糖 | 59.2 | 91.2 |
| 菊苣中的纯菊粉 | 95.0 | 92.3 |
附录：
A. 确定由于以下原因而低估果聚糖含量的程度 水解菊粉的硼氢化物还原：
- 准确称取约40mg FOS或纯果聚糖，放入干燥的派热克斯螺帽中 培养管（25 x 150 mm）并加入40 mL蒸馏水。松松地盖住管子。 在沸水浴中加热试管10分钟，以溶解果聚糖并搅拌 5和10分钟后，将管内容物放入涡流混合器中。
- 让溶液冷却至室温，然后混合试管内容物 彻底。
- 准确地将0.2 mL等分溶液分配到玻璃试管底部 （16 x 100 mm）并加入0.2 mL pH 4.5的100 mm醋酸钠缓冲液（缓冲液2）和 充分混合。
- 按照标准果聚糖程序从步骤B.3进行到步骤C.6（包括C.6和C.6）， 第8页），并测量不含果糖的试管的吸光度 潜伏期这给出了硼氢化物还原的果聚糖样品的吸光度 （BRF）。
玻璃试管（16 x 120 mm），加入0.9 mL pH 4.5的100 mm醋酸钠缓冲液（缓冲液2）在剧烈搅拌下加入试管中。
6.准确小心地将0.2 mL等分溶液转移到
三个玻璃试管（16 x 100 mm），按照以下步骤进行果聚糖水解标准果聚糖程序；步骤C.2至C.6。这给了非硼氢化物还原的果聚糖样品（NBRF）的吸光度。按照以下计算硼氢化物还原后标准程序中果聚糖的回收率百分比如下：
回收率=吸光度BRF/吸光度NBRF x 100
参考文献：
1. Lewis, D. H. (1993).低聚果聚糖的命名和图示-供讨论的论文。新植物学家， 124, 583-595.
2. Pontis, H. G. (1966). Observations on the de novo synthesis of fructosans
in vivo. Arch Biochem Biochem., 116, 416-423.
3. McCleary, B. V. & Blakeney, A. B. (1999).体内果糖从头合成的观察。 Cereal Foods World, 44, 398-406.
4. Longland, A. C., Dhanoa, M. S. & Harris, P. A. (2011). 比色法和高效液相色谱法测定马牧草中果聚糖的比较。 J. Sci. Food Agric, 92, 1878-1885.
5. McCleary, B. V., Charmier, L., McKie,V. A. & Rogowski, A. (2019). 动物食品（动物饲料、宠物食品和配料）中果聚糖（菊粉、FOS、Levan和支链果聚糖）的测定：单一实验室验证， First Action 2018.07. J. AOAC International, 102(3), 883-892.
6. Lever, M. (1973). 对羟基苯甲酸酰肼比色荧光法测定碳水化合物。 Biochem. Med. 7(2), 274-281.
7. McCleary, B. V, Murphy, A. & Mugford, D. C. (1997). 酶/分光光度法测定食品中的低聚果糖和果聚糖多糖：合作研究。 J. AOAC International, 83, 356-364.
相关文章
更多 >