图. 异位表达对谱系示踪的影响^[1]

上一期，我们讲述了双重组酶介导的独家报告基因类型，这种类型常用于标记 A⁺B^-（反之亦然）的细胞类型，这种标记存在先后顺序，相反的先后顺序会极大的影响后续的标记结果。而本次课程，我们来讲述另一种常用的标记A⁺B^-的报告基因系统——嵌套报告基因系统。

谱系示踪系类课程往期回顾：
【谱系示踪系列第一期】基础细胞标记方式
【谱系示踪系列第二期】单重组酶介导的多色报告系统方法
【谱系示踪系列第三期】多重组酶介导的交叉报告基因方法
谱系示踪的难点——基因标记的异位表达如何避免？（上） 

嵌套报告基因系统

嵌套报告基因系统的结构是 Rosa26-CAG-site2-site1-Stop-site1-reporter A-site2-reporter B。这类系统是利用两个重组系统，将一对识别位点放置于另一对识别位点与报告基因的两端，形成一个重组系统包裹着另一个重组系统的嵌套结构。如果内部的重组系统发生重组后，外部的重组系统仍然可以发生第二次重组；但外部重组系统发生重组时，内部的序列全部被切除，无法进行再次重组。

以下图为例，嵌套报告基因小鼠的基因重组为：

图. 嵌套报告基因小鼠的基因重组图解^[1]

1 A⁺B^- 细胞：
makerA 介导 Cre 酶表达，Cre 酶会切除两个 loxP 位点之间的序列（第一个 stop 序列被切除）。该系统按照启动子的方向，表达绿色荧光 ZsGreen。

2 A⁺B⁺ 细胞：
makerB 介导 Dre 酶表达，Dre 酶会切除两个 Rox 位点之间的序列（绿色荧光 ZsGreen、一对 Loxp 位点与全部的 stop 序列被切除），之后，该系统按照启动子的方向，表达红色荧光 tdTomato。

3 A^-B⁺ 细胞：
makerB 介导 Dre 酶表达，Dre 酶会切除两个 Rox 位点之间的序列（绿色荧光 ZsGreen、一对 Loxp 位点与全部的 stop 序列被切除），之后，该系统按照启动子的方向，表达红色荧光 tdTomato。

因此，A⁺B^-细胞被标记为绿色。A^-B⁺细胞、A⁺B⁺细胞被标记为红色。

嵌套报告基因小鼠如何帮助我们避免基因标记的异位表达呢？若我们想标记 MarkerA 的细胞，启动子 A 介导的 Cre-loxP 内部重组可能导致细胞 A 呈绿色。然而，如果启动子 A 在“不需要的”细胞 B（A⁺B⁺细胞）中也被激活，由于 B 类型细胞中特定启动子 B 驱动的外部 Dre-rox 重组已经去除 ZsGreen 基因，因此这部分“不需要的”细胞 B（A⁺B⁺细胞）仍呈现红色。通过使用嵌套报告基因系统将异位表达的细胞标记为其他颜色，从而排除 MarkerA 异位表达的影响。

案例1

Sox9+ 胆道上皮细胞是否在肝脏再生过程中形成肝细胞仍然存在争议。一些谱系追踪研究报告说，Sox9-CreER 标记的胆道上皮细胞（BEC）可能有助于体内平衡和损伤后的肝细胞；其他研究报告说，新产生的肝细胞来源于损伤后预先存在的肝细胞。值得注意的是，Sox9 在 BEC 和一些门脉周围肝细胞中表达，这导致使用传统的 Sox9-CreER 标记不够准确，新的肝细胞可能来自Sox9-CreER 标记的预先存在的肝细胞。
 

图. 使用传统的方法标记 Sox9⁺ 细胞无法准确标记 BECs^[2]

因此利用肝细胞特异性标记白蛋白 Alb-DreER与嵌套报告基因系统可区分Sox9+ BEC和Sox9+ 肝细胞。Sox9+ BEC被标记为绿色，Sox9+ Alb+肝细胞被标记为红色，Alb+肝细胞也被标记为红色。至此，精确标记的ZsGreen+ BEC和tdTomato+ 肝细胞可用于重新评估 Sox9+ BEC 在肝脏修复过程中对肝细胞的贡献。针对肝损伤后的小鼠进行荧光检测分析表明，BEC 不会再生新的肝细胞，而只是在CCl₄ 诱导的肝损伤后增殖以补充 BEC。
 

图. 嵌套报告基因系统准确标记 BECs^[1]

因此，嵌套报告系统可用于破解一些定义具有已知阳性和阴性 marker 的干细胞的细胞命运。这种方式较独家报告基因系统的优势是 Dre-rox 和 Cre-loxP 的重组顺序不会影响最终结果，并且，嵌套报告基因系统更适合使用双诱导型重组系统（例如 CreER 和 DreER）进行细胞谱系示踪。

那么，经过两期的学习，处理基因异位表达的两套报告基因系统大家了解了吗？，我们来再次复习一下：

嵌套报告基因系统
Nested reporter systems

• 嵌套报告基因系统的结构是 Rosa26-CAG-site2-site1-Stop-site1-reporter A-site2-reporter B。
• 嵌套报告系统可用于破解一些定义具有已知阳性和阴性marker的干细胞的细胞命运。
• Dre-rox 和 Cre-loxP 的重组顺序不会影响最终结果
• 更适合使用双诱导型重组系统

独家报告基因系统
Exclusive reporter systems

• 独家报告基因系统的结构是 Rosa26-CAG-site1-site2-Stop-site1-reporter A-Stop-site2-reporter B。
• 独家报告系统可用于破解一些定义具有已知阳性和阴性marker的干细胞的细胞命运。
• 这种标记存在先后顺序，相反的先后顺序会极大的影响后续的标记结果。
• 建议两个重组酶中一种采用可诱导类型的重组酶，从而合理控制重组发生的先后顺序。

那在实际设计实验时，我们应该如何选择报告系统呢？
 

嵌套报告基因系统VS独家报告基因系统

选择哪种双报告系统取决是否需要控制A&B的表达重组酶的时间，以及重组酶的类型选择。

情况一
A&B不仅在目的组织中特异性表达，也在发育期/干细胞期广泛表达。
在这种情况下，由于AB表达位置存在发育期表达的干扰，因而需控制A、B蛋白的表达时间，此时存在两种情况：

a. 仅需控制单个marker的表达时间：
以marker A 需控制表达为例，由于marker A需调控表达时间，因而需使用A介导的可诱导的重组酶。此时，B介导的重组酶可以选择可诱导的或者是组成型的（无需诱导）。如果选择组成型的话，请确保A和B发生的重组顺序正确，即可选择独家报告系统；如果选择可诱导的，这时我们需选择嵌套报告系统。

b. 需控制双个marker的表达时间：
这种情况下，A与B都需要选择可诱导的重组酶，这时我们需选择嵌套报告系统。

情况二
A&B仅在目的组织中特异性表达，不会在发育期/干细胞期表达。
在这种情况下，无需调控A&B的表达时间，选择哪种双报告系统就取决于重组工具的类型，如果B介导的重组工具是组成型的，而A介导的重组工具是诱导型的，即可选择独家报告系统；如果A和B介导的重组都是可诱导的，即可选择嵌套报告系统。

多重组酶介导的遗传方法增强了细胞命运图谱的特异性和精确性，从而可以在生物过程中发现前所未有的细胞事件。策略的选择主要取决于基因表达、可用的小鼠工具和要解决的科学问题。在避免基因异位表达方面，我们不仅可以在报告小鼠方面做文章，我们还可以针对重组酶进行设计。

下一期鼠博士为大家讲解可用于避免基因异位表达的loxCre与roxCre报告系统。这一报告系统的神奇之处在于一种重组酶的活性受到另一种重组酶的调控，这种制约关系可帮助我们更精准地标记目的细胞。请大家敬请期待~

Reference：
[1] He L, Li Y, Li Y, Pu W, Huang X, Tian X, Wang Y, Zhang H, Liu Q, Zhang L, Zhao H, Tang J, Ji H, Cai D, Han Z, Han Z, Nie Y, Hu S, Wang QD, Sun R, Fei J, Wang F, Chen T, Yan Y, Huang H, Pu WT, Zhou B. Enhancing the precision of genetic lineage tracing using dual recombinases. Nat Med. 2017 Dec;23(12):1488-1498. doi: 10.1038/nm.4437. Epub 2017 Nov 13. PMID: 29131159; PMCID: PMC6913096.

[2] Liu K, Jin H, Zhou B. Genetic lineage tracing with multiple DNA recombinases: A user's guide for conducting more precise cell fate mapping studies. J Biol Chem. 2020 May 8;295(19):6413-6424. doi: 10.1074/jbc.REV120.011631. Epub 2020 Mar 25. PMID: 32213599; PMCID: PMC7212637.

上海南方模式生物科技股份有限公司（Shanghai Model Organisms Center, Inc.，简称"南模生物"），成立于2000年9月，是一家上交所科创板上市高科技生物公司（股票代码：688265），始终以编辑基因、解码生命为己任，专注于模式生物领域，打造了以基因修饰动物模型研发为核心，涵盖多物种模型构建、饲养繁育、表型分析、药物临床前评价等多个技术平台，致力于为全球高校、科研院所、制药企业等客户提供全方位、一体化的基因修饰动物模型产品解决方案。