Pipetty电动移液器在猪蓝耳病毒检测（实时RT-PCR）中的应用
2025-08-25 来源:广州程淇生物 点击次数:102
方案摘要：猪繁殖与呼吸综合征，是由病毒（PRRSV）感染猪引起的一种高度传染性疫病，临床表现为母猪繁殖系统障碍，断奶仔猪消瘦、生长迟缓以及死亡率增加。该病能引起猪体温升高、呼吸困难，导致猪耳朵发绀，又称蓝耳病，为提升猪蓝耳病毒 实时RT-PCR 检测效率与准确性，Pipetty 电动移液器凭借核心优势适配全流程需求，配合温度补偿，可减少手部温度导致的移液波动，保障试剂添加精准，降低假阴性风险，为猪蓝耳病防控提供可靠支撑。
方案详情：
一、实验原理
实时RT-PCR 检测猪蓝耳病（PRRS），核心是针对猪蓝耳病病毒（PRRSV，RNA 病毒）的实时 RT-PCR 技术：先通过逆转录将病毒 RNA 转为可扩增的 cDNA，再经 PCR 循环（变性、退火、延伸）使病毒靶序列指数级增长；过程中利用荧光物质（如 TaqMan 探针）实时监测，荧光信号随靶序列增加同步增强；最终以荧光达阈值的循环数（Ct 值）判断 —Ct 值越小病毒量越高，结合阴 / 阳性对照，实现对病毒的特异定量检测。
二、实验准备
1、设配和材料
① Pipetty电动移液器MSIC01-03-250、MSIC01-02-1000及配套吸头；
② 荧光PCR 仪；
③ 高速台式冷冻离心机（4 ℃，离心速度 12 000 r/min 以上）；
④ 混匀器；
⑤ 冰箱（2℃~8 ℃、-20 ℃和-70 ℃）；
2、试剂和材料
① 商品化的 RNA 提取裂解液；
② 三氯甲烷；
③ 异丙醇（-20 ℃预冷）；
④ DEPC 水；
⑤ 75%乙醇；
⑥ dNTPS（含 dATP、dTTP、dCTP、dGTP，各 10 mmol/L）；
⑦ RT-PCR 反转录系统：AMV或 M-MLV反转录酶、Taq酶；
⑧ PRRSV-1 实时 RT-PCR 引物与探针序列
引物与探针序列根据 GenBank 中欧洲株 ORF6/ORF7 保守区域序列设计,引物的序列为：
上游引物 P1：5'-CAGATGCAGAYTGTGTTGCCT-3'；
下游引物 P2：5'-TGGAGDCCTGCAGCACTTTC-3'；
探针序列 P3：5'-(FAM)ATACATTCTGGCCCCTGCCCAYCACGT(TAMRA)-3'；
⑨ PRRSV-2 实时 RT-PCR 引物与探针序列
引物与探针序列根据 GenBank 内美洲株 ORF7/3'UTR 保守区域序列设计,引物的序列为：
上游引物 P1：5'-GCACTGATTGACAYTGTGCC-3'；
下游引物 P2：5'-CGCATGGTTCTCGCCAAT-3'；
探针序列 P3：5'-(FAM)AGTCACCTATTCAATTAGGGCGACCG(TAMRA)-3'。
三、实验步骤
1、样本总 RNA 的提取
a） 取灭菌的 1.5 mL离心管，基于样本数量进行编号。每管加入 600 μL 细胞裂解液，使用Pipetty电动移液器，设置连续分液功能，然后分别加入被检样本、阴性对照、阳性对照、空白对照（无核酸酶水）各 200μL，每加完一个试剂换用一个吸头，再各加入 200 μL 三氯甲烷，在混匀器上振荡混匀5 s。于4 ℃经 12 000 r/min 离心 15 min。
b） 取相同数量灭菌的 1.5 mL离心管，加入 500μL异丙醇。吸取各管中的上清液（至少 500 μL）转移至相应的管中，并颠倒混匀。
c） 于4 ℃经 12 000 r/min 离心 15 min，小心倒去上清液，倒置于吸水纸上吸干液体，然后加入600 μL 75%乙醇进行洗涤。
d） 于4 ℃、12 000 r/min 离心 10 min，小心倒去上清液，倒置于吸水纸上吸干液体。
e） 64 000 r/min 离心 10 s，将管壁上的残余液体甩至管底部，用微量移液器吸干液体，室温干燥3 min。
f） 使用Pipetty连续分液模式，加入 11 μL DEPC水，混匀模式，自动混匀，以溶解管壁上的 RNA，2 000 r/min 离心5s，置于冰上备用。提取的 RNA 应在 2h内进行 RT-PCR 扩增，否则应置于-70 ℃冰箱保存。
2、分别使用引物和探针，检测 PRRSV-1 和 PRRSV-2。实时 RT-PCR 反应体系见表 3。设置混匀模式，将各种试剂充分混匀，2 000 r/min 离心 2 min。将 15 μL 实时 RT-PCR 反应混合液加入 PCR 反应管，然后加入 10 μL样本 RNA 模板，密封反应管，500 r/min 离心30s。将所有检测样本的PCR 管放入荧光 PCR 仪中。每次进行实时 RT-PCR 检测均应设阳性对照、阴性对照及空白对照。
3、反转录，42 ℃（AMV）或 50 ℃（M-MLV）30 min；预变性，92 ℃ 3 min；预扩增，92 ℃ 变性 10 s，45 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸 1 min，5 个循环；扩增，92 ℃变性 10 s，60 ℃ 退火延伸 30 s，40 个循环。在扩增阶段每次循环的 60 ℃ 退火延伸时收集荧光信号。
四、结果判定
1、试验成立条件：阳性对照的 Ct 值应<28 且出现特异性扩增曲线，阴性对照应无 Ct 值或Ct 值≥40 且无特异性扩增曲线，试验结果有效，否则，应重新进行试验。
2、被检样本 Ct 值≤30 且出现特异性扩增曲线，判为阳性；当无 Ct 值或 Ct值≥40，判为阴性；当30
方案详情：
一、实验原理
实时RT-PCR 检测猪蓝耳病（PRRS），核心是针对猪蓝耳病病毒（PRRSV，RNA 病毒）的实时 RT-PCR 技术：先通过逆转录将病毒 RNA 转为可扩增的 cDNA，再经 PCR 循环（变性、退火、延伸）使病毒靶序列指数级增长；过程中利用荧光物质（如 TaqMan 探针）实时监测，荧光信号随靶序列增加同步增强；最终以荧光达阈值的循环数（Ct 值）判断 —Ct 值越小病毒量越高，结合阴 / 阳性对照，实现对病毒的特异定量检测。
二、实验准备
1、设配和材料
① Pipetty电动移液器MSIC01-03-250、MSIC01-02-1000及配套吸头；
② 荧光PCR 仪；
③ 高速台式冷冻离心机（4 ℃，离心速度 12 000 r/min 以上）；
④ 混匀器；
⑤ 冰箱（2℃~8 ℃、-20 ℃和-70 ℃）；
2、试剂和材料
① 商品化的 RNA 提取裂解液；
② 三氯甲烷；
③ 异丙醇（-20 ℃预冷）；
④ DEPC 水；
⑤ 75%乙醇；
⑥ dNTPS（含 dATP、dTTP、dCTP、dGTP，各 10 mmol/L）；
⑦ RT-PCR 反转录系统：AMV或 M-MLV反转录酶、Taq酶；
⑧ PRRSV-1 实时 RT-PCR 引物与探针序列
引物与探针序列根据 GenBank 中欧洲株 ORF6/ORF7 保守区域序列设计,引物的序列为：
上游引物 P1：5'-CAGATGCAGAYTGTGTTGCCT-3'；
下游引物 P2：5'-TGGAGDCCTGCAGCACTTTC-3'；
探针序列 P3：5'-(FAM)ATACATTCTGGCCCCTGCCCAYCACGT(TAMRA)-3'；
⑨ PRRSV-2 实时 RT-PCR 引物与探针序列
引物与探针序列根据 GenBank 内美洲株 ORF7/3'UTR 保守区域序列设计,引物的序列为：
上游引物 P1：5'-GCACTGATTGACAYTGTGCC-3'；
下游引物 P2：5'-CGCATGGTTCTCGCCAAT-3'；
探针序列 P3：5'-(FAM)AGTCACCTATTCAATTAGGGCGACCG(TAMRA)-3'。
三、实验步骤
1、样本总 RNA 的提取
a） 取灭菌的 1.5 mL离心管，基于样本数量进行编号。每管加入 600 μL 细胞裂解液，使用Pipetty电动移液器，设置连续分液功能，然后分别加入被检样本、阴性对照、阳性对照、空白对照（无核酸酶水）各 200μL，每加完一个试剂换用一个吸头，再各加入 200 μL 三氯甲烷，在混匀器上振荡混匀5 s。于4 ℃经 12 000 r/min 离心 15 min。
b） 取相同数量灭菌的 1.5 mL离心管，加入 500μL异丙醇。吸取各管中的上清液（至少 500 μL）转移至相应的管中，并颠倒混匀。
c） 于4 ℃经 12 000 r/min 离心 15 min，小心倒去上清液，倒置于吸水纸上吸干液体，然后加入600 μL 75%乙醇进行洗涤。
d） 于4 ℃、12 000 r/min 离心 10 min，小心倒去上清液，倒置于吸水纸上吸干液体。
e） 64 000 r/min 离心 10 s，将管壁上的残余液体甩至管底部，用微量移液器吸干液体，室温干燥3 min。
f） 使用Pipetty连续分液模式，加入 11 μL DEPC水，混匀模式，自动混匀，以溶解管壁上的 RNA，2 000 r/min 离心5s，置于冰上备用。提取的 RNA 应在 2h内进行 RT-PCR 扩增，否则应置于-70 ℃冰箱保存。
2、分别使用引物和探针，检测 PRRSV-1 和 PRRSV-2。实时 RT-PCR 反应体系见表 3。设置混匀模式，将各种试剂充分混匀，2 000 r/min 离心 2 min。将 15 μL 实时 RT-PCR 反应混合液加入 PCR 反应管，然后加入 10 μL样本 RNA 模板，密封反应管，500 r/min 离心30s。将所有检测样本的PCR 管放入荧光 PCR 仪中。每次进行实时 RT-PCR 检测均应设阳性对照、阴性对照及空白对照。
3、反转录，42 ℃（AMV）或 50 ℃（M-MLV）30 min；预变性，92 ℃ 3 min；预扩增，92 ℃ 变性 10 s，45 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸 1 min，5 个循环；扩增，92 ℃变性 10 s，60 ℃ 退火延伸 30 s，40 个循环。在扩增阶段每次循环的 60 ℃ 退火延伸时收集荧光信号。
四、结果判定
1、试验成立条件：阳性对照的 Ct 值应<28 且出现特异性扩增曲线，阴性对照应无 Ct 值或Ct 值≥40 且无特异性扩增曲线，试验结果有效，否则，应重新进行试验。
2、被检样本 Ct 值≤30 且出现特异性扩增曲线，判为阳性；当无 Ct 值或 Ct值≥40，判为阴性；当30
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