方案摘要：猪繁殖与呼吸综合征，是由病毒（PRRSV）感染猪引起的一种高度传染性疫病，临床表现为母猪繁殖系统障碍，断奶仔猪消瘦、生长迟缓以及死亡率增加。该病能引起猪体温升高、呼吸困难，导致猪耳朵发绀，又称蓝耳病，间接 ELISA 检测是临床和实验室中常用的血清学检测方法，核心目的是通过检测猪血清 / 血浆中的 PRRSV 特异性抗体，判断猪只是否感染过 PRRSV 或接种疫苗后是否产生免疫应答。使用Pipetty电动移液器连续多次分液功能，可以大幅缩短加样时间，降低人为引起的精度误差，减少使用者的手部疲劳，有效提升了检测效率。
 
方案详情：
一、实验原理
      该方法通过检测猪血清中 PRRSV 特异性抗体，判断感染或疫苗免疫情况，核心为 “固相抗原捕获 + 酶标二抗信号放大”：先将 PRRSV 特异性抗原（需匹配美洲型 / 欧洲型）包被酶标板并封闭，加入待检样本后，若含目标抗体则与抗原结合，洗去游离成分；再加入酶标抗猪 IgG 二抗，结合形成“抗原 - 抗体 - 酶标二抗”复合物，洗板后加底物显色。通过酶标仪读 OD 值，结合阴阳性对照定临界值判读结果。需注意：无法区分自然感染与疫苗免疫，感染后 7-14 天内抗体未产生可能漏检。
二、‌实验准备
1、设配和材料
① Pipetty电动移液器MSIC01-03-250、MSIC01-02-1000及配套吸头；
② 96孔平底聚苯乙烯酶标反应板；
③ 酶联免疫测定仪；
④ 37 ℃恒温箱。
 
2、试剂和材料
① PRRSV 抗原：提纯的 PRRSV 重组 N蛋白抗原（PRRSV-1或 PRRSV-2或其混合抗原）；
② PRRSV 阳性血清、阴性血清、HRP-免抗猪IgG结合物。使用前用稀释液稀释至工作浓度；
③ 洗涤液、血清稀释液、显色/底物溶液（TMB-H₂0₂）、抗原稀释液、封闭液等（也可使用商品化的检测 PRRSV N蛋白抗体的试剂盒）。
 
三、实验步骤
1、用抗原稀释液将 PRRSV抗原稀释成工作浓度，使用Pipetty电动移液器，设置连续分液模式，每孔 100 μL，加入 96 孔反应板中，封板后置湿盒内 37 ℃恒温箱中 60 min，然后放入4℃冰箱过夜。
 
2、弃去板中稀释液，加洗涤液洗板，300μL/孔，洗涤3次，每次1min，在吸水纸上轻轻拍干。
3、加入封闭液，200μL/孔，封板后置湿盒内 37 ℃恒温箱中反应 60 min。
4、用步骤2的方式，再一次进行洗涤。
5、取5 μL血清样本，加入195μL血清稀释液，自动混匀，进行1：40稀释。在 PRRSV 抗原包被反应板中加入稀释的被检血清、阳性血清对照和阴性血清对照，每孔100μL。阳性血清对照和阴性血清对照名加入相邻的2个孔，每份血清样本加1孔。封板后置湿盒内于 37 ℃恒温箱中反应 30 min。
 
6、用步骤2的方式，再一次进行洗涤。
7、加入工作浓度的 HRP-免抗猪 IgG 结合物，100 μL/孔，封板后置湿盒内于 37 ℃恒温箱中反应30 min。
8、用步骤2的方式，再一次进行洗涤。
9、加入新配制的显色/底物溶液（TMB-H₂O₂），100 μL/孔，封板后在 37 ℃恒温箱中避光反应15 min。
10、加入反应终止液（1 mol/L 氢氟酸溶液或 10%SDS 溶液），100 μL/孔，终止反应。
11、光密度（OD）值测定：在酶联免疫测定仪上读取反应板各孔波长450 nm（氢氟酸终止）或650 nm（SDS 终止）的 OD值。
 
四、结果判定
1、试验成立条件:阳性血清对照平均 OD 值与阴性血清对照平均 OD 值的差值≥0.15 时，试验成立。否则，应重新进行试验。
2、计算血清样本的 S/P比值。若被检血清样本的 S/P比值≥0.4，判定为 PRRSV 抗体阳性。被检血清样本的 S/P 比值<0.3，判定为PRRSV 抗体阴性。0.3≤被检血清样本的 S/P 比值<0.4，判定为可疑；对可疑样本重复检测一次，若仍为可疑，则可判定为阳性。
血清样本 S/P 比值的计算公式：S/P=（样本 OD值 - 阴性血清对照平均 OD值）/（阳性血清对照平均 OD 值 - 阴性血清对照平均 OD 值）。