红外光谱成像在活体研究中面临灵敏度低和分辨率差的挑战，尤其是在反射模式下。为了突破这一瓶颈，本研究报道了一种斜向光热显微镜（Oblique Photothermal Microscope, OPTM），实现了活体亚微米分辨率的高灵敏度红外光谱成像。传统光热测量仅通过光圈捕获少量探针光子来提取光热信号，而OPTM采用差分分裂检测器放置在样品表面，收集更多光子并通过平衡检测抑制激光噪声。凭借其提升的灵敏度，OPTM能够在无光损伤条件下对皮肤进行低剂量红外成像。实验展示了小鼠和人类皮肤下层代谢标记物的深度分辨活体成像，并追踪了局部药物在皮肤内的分布。OPTM为活体原位分子分析提供了一个高灵敏度成像平台。

本论文的重要发现者包括Mingsheng Li、Sheng Xiao、Hongli Ni、Guangrui Ding、Yuhao Yuan、Carolyn Marar、Jerome Mertz和Ji-Xin Cheng。他们共同发表的论文“Ultrasensitive in vivo infrared spectroscopic imaging via oblique photothermal microscopy”于2025年7月在《Nature Communications》期刊上在线发表。

重要发现
01技术原理与仿真结果
斜向光热显微镜（OPTM）的核心创新在于其检测策略的变革。传统中红外光热（MIP）显微镜在反射模式下使用光圈过滤后向散射光子，导致光子收集效率低。OPTM则通过将差分分裂检测器直接置于样品表面，收集斜向传播的探针光子，从而大幅提升信号捕获能力。仿真结果显示，OPTM的光子收集效率比传统方法提高约500倍，同时通过平衡检测将激光噪声抑制12倍。这种设计利用光热调制引起的折射率变化，生成光热相位梯度信号，作为分子敏感性的高效读出机制。

OPTM仪器设计包括脉冲红外激光和连续波可见激光作为泵浦和探针源，通过反射中继光学和反射物镜减少色差。信号处理流程将分裂检测器的输出分为AC和DC成分，通过锁相放大和向量运算生成光热相位梯度图像和吸收图像，实现实时分子成像。

活体小鼠皮肤成像展示了OPTM在生物医学中的潜力。通过多光谱成像，OPTM区分了脂肪细胞中的游离脂肪酸和脂质酯，其信噪比优于传统MIP显微镜8倍。深度分辨成像揭示了皮肤不同层（如角质层、表皮层）的蛋白质和脂质分布，分辨率达亚微米级。

药物追踪实验进一步凸显了OPTM的应用价值。对局部施用过氧化苯甲酰（BPO）的活体小鼠皮肤进行深度成像，结合LASSO光谱解混算法，量化了药物在毛囊中的递送效率。结果显示，BPO主要通过毛囊开口渗透，但效率低于30%，为药物开发提供了新见解。

人类皮肤成像实验证实了OPTM的临床适用性。在志愿者前臂皮肤中，OPTM无创可视化了代谢标记物和药物分布，展示了其在健康诊断和透皮药物监测中的前景。OPTM通过斜向光热检测机制，实现了高灵敏度、高分辨率的活体红外成像。其技术优势包括提升的光子收集效率、有效的噪声抑制以及深度分辨能力，为生物医学研究提供了强大工具。

创新与亮点
01突破成像难题
OPTM解决了活体红外光谱成像的两大核心难题：灵敏度和分辨率不足。传统技术如傅里叶变换红外光谱（FTIR）和光声红外显微镜受限于衍射极限和光子衰减，无法在活体中实现微米级成像。OPTM通过斜向检测策略，将光子收集效率提升500倍，噪声抑制12倍，打破了活体应用的壁垒。其亚微米分辨率克服了红外波长的衍射限制，使纳米级化学可视化在活体中成为可能。

总结与展望
OPTM技术通过斜向光热检测机制，显著提升了活体红外光谱成像的灵敏度和分辨率，为分子级生物医学研究开辟了新道路。其创新性体现在光子收集效率的优化和噪声抑制策略上，成功应用于小鼠和人类皮肤的代谢标记物成像及药物追踪。未来，通过使用更长波长的探针光源，OPTM有望进一步增加穿透深度，扩展至更复杂的组织成像。此外，结合计算重建方法如希尔伯特变换，可以提升图像质量，减少伪影。OPTM作为一个平台技术，不仅限于中红外窗口，还可适配于其他光热显微镜系统，推动其在基础研究和临床翻译中的广泛应用。总之，OPTM代表了活体分子成像的重要进展，有望在疾病诊断和药物开发中发挥关键作用。

DOI:10.1038/s41467-025-61332-w.