突破：一种使小鼠脑皮层100-400微米深度荧光增强的生物传感器
2025-11-21 来源:本站 点击次数:126在哺乳动物体内，L-乳酸日益被视为一种重要的细胞间能量载体，但其在细胞外环境中释放与摄取的空间和时间动态变化仍存在诸多未解之谜。传统监测方法如酶电极技术，虽能用于活体测量，但存在空间分辨率低、对组织具有侵入性等局限。为了以更高的时空分辨率在活体中原位、实时观测细胞外L-乳酸的动态变化，研究人员开发了一种名为R-eLACCO2.1的红色荧光基因编码生物传感器。该传感器基于乳酸结合蛋白TTHA0766与红色荧光蛋白cpmApple构建，通过定向进化与优化，实现了在培养细胞、小鼠脑切片以及活体小鼠中对细胞外L-乳酸的高灵敏度、高特异性成像。R-eLACCO2.1不仅可用于荧光强度成像，还可作为荧光寿命成像显微镜（FLIM）传感器，并能与绿色荧光钙离子指示剂（如GCaMP）进行双色成像，从而同步监测神经活动与代谢变化。
本研究的核心贡献者包括Yuki Kamijo, Philipp Machler, Natalie Ness, Cong Quang Vu, Tsukasa Kusakizako, Jamsad Mannuthodikayil, Zaneta Ku, Marc Boisvert, Ekaterina Grebenik, Ikumi Miyazaki, Rina Hashizume, Haruaki Sato, Rui Liu, Yukiko Hori, Taisuke Tomita, Tetsuro Katayama, Akihiro Furube, Gabriela Caraveo, Marie-Eve Paquet, Mikhail Drobizhev, Osamu Nureki, Satoshi Arai, Marco Brancaccio, Robert E. Campbell, David Kleinfeld & Yusuke Nasu。他们的研究成果以论文“A red fluorescent genetically encoded biosensor for in vivo imaging of extracellular L-lactate dynamics”的形式，于2025年10月发表在学术期刊《Nature Communications》上。
重要发现
01核心贡献：新一代红色荧光乳酸传感器的诞生
本研究最核心的贡献是成功开发了R-eLACCO2.1，这是首个高性能的红色荧光细胞外L-乳酸基因编码生物传感器。其开发过程始于将绿色乳酸传感器eLACCO1中的绿色荧光蛋白（cpGFP）替换为红色荧光蛋白（cpmApple），构建出初始原型R-eLACCO0.1。随后，研究团队通过多轮定向进化（包括随机突变和定点诱变），大幅提升了传感器的荧光响应度（ΔF/F），最终获得了高度优化的变体R-eLACCO2。通过引入Leu79Ile突变以调节其对乳酸的亲和力，得到了最终的工作版本R-eLACCO2.1，其表观Kd为5.1 mM，非常适合感知生理范围内的细胞外乳酸浓度变化。同时，研究人员还构建了无响应突变体R-deLACCOctrl作为对照。
在光学特性上，R-eLACCO2.1展现出卓越的性能。在结合L-乳酸后，其最大激发峰从578 nm蓝移至566 nm，最大发射峰从602 nm蓝移至594 nm，这种激发光谱的位移是其在比率式或强度测量中产生高对比度响应的基础。其荧光寿命也会随乳酸浓度增加而显著变化（Δτ ≈ 0.37 ns），这使其成为一种有效的FLIM生物传感器。FLIM技术的优势在于其信号不受传感器表达浓度、激发光功率和焦点漂移的影响，非常适合在复杂的活体环境中进行定量成像。此外，R-eLACCO2.1在双光子激发下也表现出良好的特性，使其能够用于深层组织成像。研究人员还通过冷冻电镜技术解析了R-eLACCO2在乳酸结合状态下的高分辨率结构（2.7 Å），揭示了其分子内部关键氨基酸残基（如Lys211）在乳酸结合后通过调控发色团微环境来改变荧光性质的机制。
03细胞表面定位的精准优化
对于细胞外靶向的传感器而言，能否高效且特异地定位到细胞膜表面至关重要。研究团队对此进行了系统性优化。他们筛选了多种C-末端锚定域（包括基于蛋白质的跨膜域和基于糖基磷脂酰肌醇GPI的锚）以及N-末端信号肽序列。结果表明，GPI锚定系统（如COBRA, CD59, GFRA1）能实现高效的细胞表面定位，而蛋白质跨膜锚定效果不佳。在信号肽筛选中，大多数序列也能引导传感器到达膜上，其中IgK、HA和pat-3序列能带来最亮的荧光信号。最终，结合荧光响应度（ΔF/F）测试，确定IgK信号肽与COBRA GPI锚的组合为R-eLACCO2.1的最佳配置，使其在HeLa细胞中ΔF/F高达6.5，远超早期版本。
04在活体成像中的突破性应用
研究的最终目的是在活体动物中验证传感器的功能。研究人员通过向小鼠初级触觉体感皮层（vS1）注射腺相关病毒（AAV），使神经元特异性表达R-eLACCO2.1。静脉注射L-乳酸后，利用双光子激光扫描显微镜结合自适应光学（AO2P）技术，在清醒小鼠大脑皮层100微米和400微米深度均观察到了R-eLACCO2.1强烈的荧光强度增加，且其信号变化与植入同一脑区的电化学乳酸探针的记录结果高度相关，证实了其在活体内的可靠性。更重要的是，R-eLACCO2.1的性能优于此前报道的绿色传感器eLACCO2.1，在活体中具有更高的灵敏度。
更引人入胜的是对内源性乳酸动态的观测。在清醒小鼠中，吹动胡须刺激或小鼠自发运动后，V1S区层II/III神经元的细胞外L-乳酸水平均呈现显著上升。而通过双色成像技术，研究人员实现了对同一批神经元同时记录R-eLACCO2.1（报告细胞外乳酸）和GCaMP6f（报告细胞内钙离子，即神经活动）。令人惊讶的是，在无明显运动事件的自发神经活动期间，他们观察到神经激活（GCaMP6f信号升高）之后，细胞外乳酸浓度会出现一个短暂的下降，随后才恢复至基线水平。这一发现暗示了神经活动可能伴随着局部乳酸的快速消耗，为了解大脑代谢与神经活动之间的复杂互动提供了全新的视角。
创新与亮点
R-eLACCO2.1的诞生，在光学成像与生物传感领域取得了多项重要突破。它成功突破了光谱限制，实现了活体代谢物的多参数同步成像。作为首个红色荧光细胞外乳酸传感器，它完美地解决了绿色荧光传感器（如eLACCO系列）与同样为绿色的神经活动指示剂（如GCaMP）在同时使用时难以区分信号的难题。这种“光谱正交性”使得研究人员能够在不相互干扰的情况下，同时对神经电活动（通过GCaMP）和能量代谢（通过R-eLACCO2.1）进行观测，为解析大脑功能提供了前所未有的多维信息。
该传感器集成了荧光强度与荧光寿命两种成像模式，极大地增强了其应用的灵活性和可靠性。FLIM模式特别适合于活体定量研究，因为它能有效克服因传感器表达量差异、组织光散射和吸收所导致的信号波动，提供更稳定、更精确的乳酸浓度读数。这种双模式兼容性使R-eLACCO2.1能够适应从细胞水平的高通量筛选到活体动物深层组织成像的多种实验场景。
首次在清醒哺乳动物中，以细胞级分辨率实时观测到了行为刺激和自发神经活动所引发的内源性细胞外乳酸动态变化。特别是发现了神经活动后乳酸可能被快速消耗的瞬时下降现象，这挑战了传统的“神经活动必然伴随乳酸产出增加”的简单认知，为重新审视和验证诸如“星形胶质细胞-神经元乳酸穿梭（ANLS）”等经典假说提供了强大的新工具。总结与展望
本研究成功开发了高性能红色荧光基因编码生物传感器R-eLACCO2.1，实现了在培养细胞、脑切片及活体小鼠中对细胞外L-乳酸动态的高时空分辨率、高特异性成像。其红色荧光特性、优异的灵敏度以及对荧光寿命成像的兼容性，使其成为研究大脑能量代谢与神经活动之间复杂关系的理想工具。利用R-eLACCO2.1，研究团队在清醒小鼠中揭示了运动和行为刺激引起的乳酸动态变化，并首次通过双色成像观察到神经活动后细胞外乳酸的瞬时消耗，为理解乳酸在大脑中的实时功能提供了全新视角。展望未来，R-eLACCO2.1作为一种强大的成像工具，将极大地推动神经科学、代谢生理学等领域的发展，特别是在探究阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化症等与乳酸代谢紊乱相关的神经系统疾病的机制方面具有广阔的应用前景。它将继续帮助科学家们描绘乳酸在哺乳动物生理与病理过程中所扮演的复杂而关键的角色。
声明：本文仅用作学术目的。
Kamijo Y, Mächler P, Ness N, Vu CQ, Kusakizako T, Mannuthodikayil J, Ku Z, Boisvert M, Grebenik E, Miyazaki I, Hashizume R, Sato H, Liu R, Hori Y, Tomita T, Katayama T, Furube A, Caraveo G, Paquet ME, Drobizhev M, Nureki O, Arai S, Brancaccio M, Campbell RE, Kleinfeld D, Nasu Y. A red fluorescent genetically encoded biosensor for in vivo imaging of extracellular L-lactate dynamics. Nat Commun. 2025 Oct 29;16(1):9531.
DOI:10.1038/s41467-025-64484-x.