本文来源于微信公众： CellTech细胞技术与生产   作者： Leo

体内（in vivo）CAR-T 疗法凭借 “无需体外细胞制备、直接输注给药” 的核心优势，成为 CAR-T 产业化的重要发展方向。但该疗法省略了体外工艺的质控缓冲环节，携带 CAR 基因的慢病毒载体需直接与宿主免疫系统相互作用，其关键质量属性（Critical Quality Attributes, CQAs）直接决定体内 CAR-T 细胞的激活效率、增殖特性与免疫反应强度，进而成为细胞因子释放综合征（CRS）发生风险、严重程度的核心调控因素。本文将系统解析体内 CAR-T 慢病毒核心 CQAs 与 CRS 的关联机制，对比体内外 CAR-T 的质控差异，并提出基于 CRS 风险控制的工艺优化路径。

一、体内 CAR-T 慢病毒的核心关键质量属性（CQAs）
体内 CAR-T 慢病毒需同时满足 “体内靶向感染效率”“基因表达可控性” 与 “生物安全性” 三大核心要求，其 CQAs 体系较体外 CAR-T 用慢病毒更为严苛，核心包括五大类：

1. 病毒滴度与感染活性 以感染性滴度（TU/mL）、靶向 T 细胞的转导效率、空壳颗粒占比为核心指标，直接决定体内 CAR-T 细胞的感染范围与激活规模；
2. 基因整合特性 涵盖整合位点特异性、单细胞整合拷贝数、原癌基因附近整合频率，影响 CAR-T 细胞的体内存活稳定性与功能持续性；
3. 纯度与杂质残留 包括宿主细胞 DNA / 蛋白残留、游离质粒 DNA、内毒素、缺损颗粒占比等，是诱发非特异性炎症的关键诱因；
4. CAR 表达调控特性 核心为启动子活性强度、T 细胞特异性元件的靶向性，决定 CAR 基因的表达部位与表达水平；
5. 载体稳定性 涉及体内半衰期、血清稳定性、靶向组织富集效率，调控 CAR-T 细胞激活的时间窗口与空间分布。

二、核心 CQAs 与 CRS 的关联机制解析
CRS 的本质是 CAR-T 细胞激活引发的 “细胞因子风暴”，而体内 CAR-T 慢病毒的 CQAs 通过调控 “CAR-T 细胞激活的规模、强度、持续性与空间分布”，直接影响炎症反应的程度与模式。
（一）病毒滴度与感染活性：CRS 强度的 “剂量开关”
体内 CAR-T 的核心风险在于慢病毒在体内的感染范围不可控，滴度与感染活性是直接调控这一过程的关键：

• 过高感染性滴度 当慢病毒滴度超过上限时，会导致外周血、淋巴组织中的大量 T 细胞被非特异性感染，CAR 阳性 T 细胞比例短时间内急剧升高。这些 CAR-T 细胞同步识别肿瘤抗原（或正常组织交叉抗原），会爆发式释放 IL-6、TNF-α、IFN-γ 等促炎细胞因子，直接诱发 3-4 级重度 CRS，表现为低血压、缺氧、多器官功能损伤。更严重的是，过高滴度可能感染巨噬细胞、内皮细胞等非 T 细胞，导致这些细胞异常表达 CAR 或直接分泌细胞因子，进一步加剧炎症风暴。
• 过低滴度或低活性病毒 低滴度或高比例空壳颗粒的慢病毒仅能感染少量 T 细胞，且 CAR 表达异质性强。这些低效激活的 CAR-T 细胞增殖能力弱、杀伤活性不足，无法快速清除肿瘤细胞，反而会持续释放低水平细胞因子，引发持续性轻症 CRS（如长期低热、乏力），甚至伴随巨噬细胞活化综合征，延长不良反应持续时间。
• 空壳颗粒的放大效应 空壳颗粒占比过高（＞30%）时，虽无感染性，但可通过表面 VSVg 包膜蛋白结合巨噬细胞、中性粒细胞的受体，触发非特异性固有免疫反应，分泌炎症因子。这种反应与 CAR-T 细胞激活的特异性炎症叠加，显著提升 CRS 发生率。

（二）基因整合特性：CRS 持续时间与远期风险的 “调控器”
慢病毒的基因整合特性直接影响 CAR-T 细胞的体内存活与功能稳定性，进而决定 CRS 的病程走向：

• 整合拷贝数 单个 T 细胞中整合多个 CAR 基因拷贝，会导致 CAR 蛋白过度表达，降低 T 细胞激活阈值。这类 CAR-T 细胞即使遇到低浓度抗原，也会释放大量细胞因子，加剧 CRS 强度。因此，体内 CAR-T 慢病毒需严格控制单拷贝整合比例（理想＞80%），避免多拷贝整合导致的 CAR 过表达。
• 整合位点特异性 慢病毒随机整合到原癌基因（如 MYC、BCL-2）或免疫调控基因（如 PD-1、CTLA-4）附近时，可能导致 CAR-T 细胞异常增殖、凋亡受阻，成为 “持续性激活” 细胞群。这类细胞在体内长期存活并分泌细胞因子，会导致 CRS 持续时间延长（超过 14 天），甚至引发迟发性 CRS 或继发性自身免疫反应。与体外 CAR-T 不同，体内 CAR-T 无法通过体外筛选剔除异常整合细胞，因此整合位点特异性是更关键的安全质控点。
• 启动子靶向性 采用 T 细胞特异性启动子（如 CD4/CD8 启动子）是体内 CAR-T 慢病毒的核心设计要求。若启动子靶向性不足，慢病毒可能在非 T 细胞（如内皮细胞、上皮细胞）中启动 CAR 表达，这些异常表达 CAR 的细胞会被免疫系统识别为 “异物”，引发免疫清除并释放炎症因子；同时可能结合正常组织抗原，触发不必要的免疫反应，叠加 CAR-T 细胞的炎症效应，加重 CRS。

（三）纯度与杂质残留：非特异性炎症的 “导火索”
体内输注的慢病毒制品中，杂质残留直接激活宿主固有免疫系统，成为 CRS 的 “预热因子”，这一影响远大于体外 CAR-T（体外工艺可通过洗涤去除部分杂质）：

• 宿主细胞 DNA / 蛋白残留 慢病毒生产过程中残留的 HEK293T 细胞 DNA（尤其是未降解片段），可通过 Toll 样受体 9（TLR9）通路激活巨噬细胞与树突状细胞；残留的宿主蛋白则通过 TLR2/4 通路激活免疫细胞，诱导促炎细胞因子分泌。这种非特异性炎症会 “预热” 免疫系统，使机体处于高敏状态，当 CAR-T 细胞激活时，细胞因子释放会被显著放大，大幅提升 CRS 严重程度。
• 游离质粒 DNA 与内毒素 传统瞬转工艺生产的慢病毒易残留游离质粒 DNA，这些 DNA 同样激活 TLR9 通路，诱导 IL-6、IL-1β 等 CRS 核心驱动因子分泌；内毒素残留（需＜0.1 EU / 剂）会直接激活补体系统，引发发热、血管通透性增加等 CRS 样症状，与 CAR-T 细胞激活的炎症反应形成 “双重打击”。而稳转工艺通过消除质粒转染步骤，可大幅降低游离质粒与杂质残留，从源头减少非特异性炎症诱因。
• 缺损颗粒的隐形作用 缺损颗粒（如缺失 CAR 基因的病毒颗粒）虽无法介导基因整合，但可通过包膜蛋白结合 T 细胞表面受体，触发不完全激活信号。这种信号不会诱导 T 细胞增殖，却会促使其分泌少量细胞因子，长期积累后可能诱发慢性炎症，增加轻症 CRS 的发生率。

（四）载体稳定性与靶向富集效率：CRS 的 “空间时间调控器”
体内慢病毒的组织靶向性与稳定性，决定了 CAR-T 细胞激活的 “空间分布” 与 “时间窗口”，进而影响 CRS 的器官特异性损伤与持续模式：

• 靶向富集效率 理想的体内 CAR-T 慢病毒需通过包膜蛋白改造（如 T 细胞特异性配体修饰）实现外周血 T 细胞的高效富集。若靶向性不足，慢病毒可能在肝、肺等器官富集，感染局部免疫细胞，导致器官特异性炎症（如肺炎、肝炎），表现为 CRS 伴随的多器官功能损伤。
• 体内半衰期 慢病毒体内半衰期过长，会导致持续感染 T 细胞，使 CAR-T 细胞激活过程延长，细胞因子释放峰值分散，引发持续性轻症 CRS；半衰期过短则可能导致感染效率不足，需提高给药剂量，反而增加 CRS 风险。因此，需将半衰期优化至 24-48 小时，实现 T 细胞的高效且可控感染。

三、基于 CRS 风险控制的体内 CAR-T 慢病毒工艺优化方向
为降低 CRS 风险，需从 “工艺优化 + 载体设计 + 严格质控” 三个维度，构建适配体内 CAR-T 的慢病毒生产体系：

1. 强化稳转平台工艺 采用细胞株生产慢病毒，消除质粒转染步骤，从源头降低游离 DNA、宿主细胞杂质残留，减少非特异性炎症诱因；同时优化无血清悬浮培养工艺，筛选高质量单克隆细胞，提高病毒滴度，感染活性与完整病毒颗粒比例。
2. 优化载体设计 一方面采用 T 细胞特异性启动子（如 CD4/CD8 启动子）+ 靶向包膜蛋白修饰，实现 CAR 基因的精准、可控表达；另一方面通过 CRISPR 介导的定点整合技术，提高慢病毒整合位点的特异性，降低异常增殖风险，减少持续性 CRS 发生。
3. 提升纯化工艺水平 高效去除空壳颗粒、缺损颗粒与杂质残留，将空壳颗粒占比控制在 20% 以下。
4. 建立精准质控体系 针对整合特性建立单拷贝整合比例、整合位点分布的检测方法；针对感染活性开发体内转导效率的预测模型；针对杂质残留采用高灵敏度检测技术（如数字 PCR 检测宿主 DNA），确保每一批次慢病毒的 CQAs 均符合 CRS 风险控制要求。

五、总结
体内 CAR-T 疗法中，慢病毒载体的 CQAs 是 CRS 风险的核心决定因素 —— 滴度与感染活性调控 CRS 的爆发强度，基因整合特性决定 CRS 的持续时间与远期风险，纯度与杂质残留是诱发非特异性炎症的 “导火索”，而靶向性与稳定性则影响 CRS 的器官损伤模式。与体外 CAR-T 相比，体内 CAR-T 对慢病毒的质控标准更严苛，需通过工艺革新、载体设计优化与精准质控体系构建，实现 CAR-T 细胞的 “可控激活”。未来，随着稳转平台技术、定点整合技术与靶向修饰技术的持续突破，体内 CAR-T 慢病毒的 CQAs 将进一步优化，CRS 风险将得到有效控制，推动体内 CAR-T 疗法向 “高效、安全、可及” 的方向发展。