本文来源于微信公众： 研学Biotech   作者： GENTOP

在生物技术和医学研究飞速发展的今天，科学家们不断尝试将不同功能的生物分子“强强联合”，创造出性能更优的新型工具。其中，抗体-寡核苷酸偶联物（AOC）正逐渐成为一颗耀眼的新星，在疾病治疗、高精度成像和超灵敏检测等领域展现出巨大潜力。

什么是抗体-寡核苷酸偶联物？
抗体-寡核苷酸偶联物，简称AOC，是一类将抗体与寡核苷酸通过化学或生物方法连接而成的嵌合生物分子。

抗体：被誉为“生物导弹”，能精准识别并结合特定抗原，广泛应用于靶向治疗和免疫检测。

寡核苷酸：短链的DNA或RNA分子，不仅承载遗传信息，还能用于基因调控、信号放大、自组装纳米结构等。

将二者的优势结合，AOC既能实现抗体的精准靶向，又能发挥寡核苷酸的多样化功能，可谓“一箭双雕”。

抗体的高亲和力（解离常数处于亚纳摩尔范围）以及寡核苷酸（ON）功能基团的多样性。正是这种功能多样性使得这些构建体能够触发从免疫应答到细胞分化、凋亡及蛋白质表达等复杂生物学机制。

AOC的一个重要特征是偶联度（DoC），它代表每个抗体上的ON分子数量。平均DoC值可通过质谱分析或凝胶电泳获得。DoC值直接决定了AOC的分子量和大小，因此影响诸如溶解性、亲和力和聚集性等理化性质。此外，ON分子显著的负电荷对抗体有重要影响，而抗体在中性pH下带正电。因此，偶联物的整体电荷与DoC值成正比。通常是具有不同DoC的组分复杂混合物。如图1所示。

图1. (a) AOC的简化示意图，(b) 平均DoC为1的赖氨酸偶联型AOC中不同DoC值组分的典型分布。

AOC的三大核心应用领域
检测、成像、治疗
1. 超高灵敏度检测
传统的蛋白检测方法（如ELISA）灵敏度有限。AOC的出现带来了革命性突破。
免疫-PCR：将DNA标签连接在抗体上，通过PCR扩增DNA信号，检测灵敏度提升高达10万倍！如图2所示。

图2.（a−c）: 不同免疫PCR方案，d: ELISA 技术的示意图; (a)顺序法（先加入一抗，再加入蛋白A/G−DNA偶联物）；(b)模块化法（先加入一抗，再加入二抗−DNA偶联物）；(c)直接免疫PCR法（加入AOC）

2. 邻近连接/延伸检测
使用一对AOC探针，只有当它们结合到相邻目标时，其连接的DNA片段才能连接或延伸，并被扩增检测，适用于研究蛋白质相互作用或翻译后修饰。

邻近连接分析（PLA）是通过巧妙结合两种现有技术——酶促DNA连接与PCR扩增而实现的。该检测方法采用一对具有不同蛋白表位亲和力的寡核苷酸（用于检测），或针对不同蛋白的寡核苷酸（用于蛋白质-蛋白质相互作用研究）。PLA探针的寡核苷酸片段设计为与后续添加的连接寡核苷酸互补。当探针被置于紧密邻近位置（即目标蛋白彼此靠近或构成蛋白质复合体时），通过添加DNA连接酶即可实现两端连接。连接产物随后可通过PCR进行扩增，而未反应的探针则保持沉默状态。如图3所示。

图3. (a) PLA与(b) PEA探针用于蛋白质检测的作用模式

为解决邻近连接分析在复杂生物液体中回收率低、效率有限的问题，Fredriksson课题组开发了基于DNA聚合酶的邻近延伸分析技术。该技术最初利用两个AOC探针在靶标介导下使互补DNA片段杂交，再经聚合酶延伸形成可qPCR检测的扩增子；后续改进为直接使用单链互补寡核苷酸，并引入超嗜热聚合酶及多靶标检测中的引物消化步骤，近期还与单细胞RNA扩增技术联用。为克服此类酶依赖方法成本高、操作繁琐的缺点，研究者进一步将AOC邻近结合与杂交链式反应结合，发展出无酶扩增版本，该策略也被用于提升细胞因子分泌细胞的检测灵敏度。

3. 电化学邻近检测
利用AOC结合目标后引起电极表面电化学信号变化，实现无需扩增的超灵敏检测。

图4a. 蛋白质检测 ECPA 的作用机制

4. 超分辨率成像
DNA-PAINT技术利用AOC将成像DNA链“停泊”在目标蛋白附近，通过荧光DNA链的瞬时结合与解离，实现纳米级分辨率的细胞成像，可同时观察多个靶标。

图4b. DNA-paint用于靶标成像的作用机制

5. 靶向治疗与药物递送
AOC在治疗领域主要发挥两种作用：
靶向递送治疗性核酸：利用抗体将siRNA或反义寡核苷酸精准送至病变细胞，用于治疗癌症、病毒感染等。
预靶向放射治疗：先注射靶向癌细胞的AOC，再注射携带放射性核素的互补DNA链，在肿瘤处原位结合，提高疗效并减少副作用。

图5. AOC在(a)抗体阵列；(b)治疗性应用；及(c)预靶向应用中的示意图

如何制备AOC？关键技术与挑战
制备AOC的方法主要分为非共价连接和共价连接两大类。

非共价方法
链霉亲和素-生物素系统：经典可靠，但容易形成混合产物。
Protein A/G系统：通过抗体Fc段结合，再与DNA连接，适用于芯片和成像。

图6. 基于非共价相互作用对的不同AOC制备方案：(a)共价连接的ON-链霉亲和素偶联物与生物素化抗体；(b)链霉亲和素与两个生物素化生物分子的连接；(c)蛋白G/Fc连接；(d)SNAP标签-BG对；(e)邻近驱动的紫外激活共价AOC制备

共价方法
这是目前主流研究方向，追求位点特异性和均一性：
经典赖氨酸：使用异双功能交联剂（如SMCC），方法通用但产物不均一。

图7. 采用胺-硫醇偶联法制备AOC

该抗体通过与含有活化酯基和马来酰亚胺残基的交联剂反应，转化为马来酰亚胺修饰底物（参见图8中的通用方案）。随后将两种反应物纯化、混合，并通过提高反应缓冲液的pH值来启动它们之间的反应。通常采用凝胶过滤法对所得产物进行纯化。

图8. 氨基-硫醇偶联通用方案

采用可光解的双功能马来酰亚胺-NHS交联剂，制备可光解DNA条形码-抗体偶联物，用于提高单个活细胞中蛋白质的检测灵敏度（图9）。该修饰使得DNA条形码可通过光解释放，从而在靶标结合后实现其分离、扩增和读取。

图9. 通过光解连接子偶联的DNA条形码AOCs及其在蛋白质检测中的应用

SATA试剂常用于在蛋白质赖氨酸残基上引入保护性硫醇基团。随后可使用羟胺轻松脱保护。该方法适用于单克隆抗体的潜在硫醇化修饰。具体步骤：首先用SATA修饰抗体以引入保护性硫醇残基；接着用 SMCC 修饰DNA片段，生成含马来酰亚胺的DNA；最后通过向SATA修饰的抗体中加入羟胺（生成游离硫醇基团）并加入活化的DNA-马来酰亚胺片段，启动偶联反应。（图10所示）

图10. 使用SATA试剂对抗体进行硫醇化处理

腙偶联：抗体首先与琥珀酰亚胺基4-羟基烟酰胺酮丙酮肼（SHyNic）反应，以在抗体中引入亲核性肼基团（图11所示）。

图11. AOC制备的腙偶联技术

DNA模板引导的蛋白质偶联：利用DNA杂交将反应基团引导至抗体特定区域，实现位点选择性标记。

通过三氨基修饰DNA制备含有三个亚硝基三乙酸（NTA）的导向性ON。随后，通过用二NHS连接体修饰互补ON，生成反应性ON，形成ON-NHS。如图12所示。

图12. DTPC 方案

当抗体与导向性ON孵育时，铜（II）介导的螯合作用会在ON的NTA手柄与抗体金属结合口袋中的组氨酸簇之间发生，从而形成非共价AOC结构（图13右所示）。随后加入互补反应性ON，使NHS活化酯与赖氨酸残基的可用游离氨基紧密接触，生成相应的共价加合物。将水解不稳定的活化酯替换为反应性ON上的醛基，以实现抗体近端赖氨酸残基的还原胺化。该方法被应用于开发一种通用策略，通过高碘酸盐裂解反应性ON中含有的1,2-二醇连接体，将醛基手柄引入去糖基化抗体（图13左所示）。

图13. 利用天然抗体的金属结合位点进行DNA模板介导的近端赖氨酸偶联，用于抗体中AOC生成（右）或醛基引入（左）

半胱氨酸残基偶联：通过基因工程将额外的保护性半胱氨酸残基整合到抗体结构中（硫醇化单抗技术）。这类抗体可用于将单抗与通过 SMCC 或 SPDB 交联剂获得的巯基反应性寡核苷酸（ON）连接，但需先进行初步去保护步骤，将保护性半胱氨酸残基转化为游离巯基（图14a所示）。另外通过部分还原抗体链间二硫键可生成游离巯基（图14b所示；参见图15中的方案）。

图14. 使用(a)工程化单克隆抗体或(b)链间二硫键还原法制备半胱氨酸连接的AOC

图15. 部分还原抗体偶联方案

点击化学：如应变促进的炔-叠氮环加成，反应高效、生物相容性好。

抗体可通过含叠氮基的异功能连接体进行修饰，以便与标记有张力炔烃的ONs进一步反应（图16中的方案）。另一种‘即插即用’的天然抗体功能化方法，采用4-叠氮苯甲酰氟（ABF ，图17所示）。ABF 试剂在抗体反应中表现出显著快于类似NHS活化酯的动力学特性，这使得在4℃和25℃条件下均能实现更高的偶联效率。因此， ABF 试剂的应用对于需要快速高效偶联敏感生物分子的场景具有显著优势。这种“即插即用”的策略进一步拓展至使用4-叠氮苯基乙二醛（APG）试剂对抗体进行精氨酸选择性功能化， 由于天然抗体中精氨酸含量低于赖氨酸，精氨酸选择性偶联技术在制备均一化抗体偶联物（AOCs）方面尤为突出。具体而言，与赖氨酸偶联（使用活化酯试剂可修饰约40-60个赖氨酸残基）不同，在相同反应条件下使用APG试剂仅需修饰3-8个不同的精氨酸残基。

图16. 插入式偶联方案

图17. 使用天然抗体赖氨酸或精氨酸残基制备的叠氮化物标记抗体的 SPAAC 功能化

狄尔斯-阿尔德反应（iEDDA）：制备含有二硫键可裂解连接子和反式环辛烯（TCO）修饰DNA标签的四嗪修饰抗体（图18a所示）。经细胞孵育和充分洗涤后，通过还原抗体与DNA组分间的二硫键连接子，可对结合于细胞表面的AOCs的DNA标签进行测序。

图18a. iEDDA反应在AOC生成中的应用

非天然氨基酸插入：通过基因密码子扩展技术，在抗体特定位点引入酮基等反应基团，实现高度均一的偶联。

例如，含酮基的非天然氨基酸（如乙酰基-L-苯丙氨酸（pAcF））可通过基因整合方式引入。利用针对pAcF的进化型正交tRNA/氨酰tRNA合成酶对，响应琥珀 UAG 密码子在抗体特定位点进行修饰。随后，pAcF的酮基可在温和反应条件下形成稳定的肟键，选择性地与氨基氧基衍生配体偶联，类似于化学Hydralink方法（图18b；参见图19中的方案）。

图18b. 肟键合在AOC生成中的应用

图19 肟键合偶联方案

当前挑战：如何在保持抗体活性的前提下，实现高产率、高均一性、高稳定性的偶联，仍是科研与产业化的核心课题。

未来展望
随着蛋白质工程、合成化学和纳米技术的进步，AOC的制备技术将更加精准、高效。其在液体活检、单细胞分析、多靶点成像、细胞疗法等前沿领域的应用前景广阔。未来，我们有望看到更多基于AOC的临床诊断试剂和靶向药物问世，真正实现“从实验室到临床”的转化。

AOC不仅代表了生物共轭化学的前沿，更是交叉学科创新的典范——它融合了免疫学、核酸化学、材料科学与工程学，为我们理解生命过程和战胜疾病提供了全新的武器。