方案摘要：本方案使用Pipetty电动移液器结合鸡胚分离、MDCK细胞分离及血凝试验（HA试验），规范实验操作，提升移液精度与实验重复性，保障马流感检测结果的准确性和可靠性，为马流感的快速筛查与病毒分离提供标准化实验参考。
 
方案详情：

• 实验原理

马流感病毒（Equine Influenza Virus, EIV）可通过鸡胚尿囊腔接种或MDCK细胞培养实现分离增殖，增殖后的病毒能使鸡红细胞发生凝集反应（血凝现象）。本实验通过Pipetty电动移液器精准移取样品、试剂及病毒液，完成样品处理、鸡胚接种、细胞孵育及HA试验等关键步骤，利用血凝反应判定病毒是否分离成功，进而实现马流感的检测。
 
 
二、‌实验准备
1、设配和材料
① Pipetty电动移液器MSIC01-03-20、MSIC01-03-250、MSIC01-03-1000；
② 恒温培养箱；
③ 鸡胚孵化器；
④ 恒温水浴锅；
⑤ 普通冰箱；
⑥ 超低温冰箱；
⑦ 低温离心机；
⑧ 二氧化碳细胞培养箱；
⑨ 倒置显微镜；
⑩ 生物安全柜；
⑪ 酒精灯；
⑫ 镊子。
 
2、试剂和材料
① 96孔V型或U型微量反应板；
② 1mL注射器和5mL注射器；
③ 双抗溶液(青霉素100000 IU/mL,链霉素1mg/mL)；
④ PBS；
⑤ 1%鸡红细胞悬液；
⑥ 10d~11d SPF 鸡胚；
⑦ 2.5%胰蛋白酶储存液(25ug/mL)；
⑧ 细胞培养皿；
⑨ MEM培养基；
⑩ MDCK细胞；
⑪ 碘酊或75%酒精；
⑫ 封口蜡。
 
 
三、实验步骤
1、将采集的马流感拭子样品充分捻动、挤干后，用Pipetty电动移液器取500μL样品液至一新的离心管中，再加入等量双抗溶液，轻轻混匀。将离心管置于低温离心机中，以3000r/min、4℃条件离心10 min，离心结束后，用Pipetty吸取上清液，用于后续SPF鸡胚或MDCK细胞接种，未用完的样品置于-70℃以下超低温冰箱保存。
2、SPF鸡胚分离
① 将孵化至10d~11d的SPF鸡胚气室部位蛋壳用碘酊或75%酒精消毒后，在气室部位蛋壳上打一个小孔，用于接种样品；
  ② 每份样品接种3枚鸡胚，每枚胚尿囊腔接种0.2mL；
 
③ 用封口蜡封孔，鸡胚置35℃孵化器内孵化，移去24h内死亡的胚，其余鸡胚继续孵化至72h；
④ 接种后72h,将鸡胚转到2℃~8℃中放置4h或过夜；
  ⑤ 取出鸡胚，先将蛋壳表面消毒，用镊子敲碎并剥离气室蛋壳，然后挑破壳膜和绒毛尿囊膜，用注射器等适宜材料收获尿囊液，取适量进行血凝试验；
  ⑥ 每胚收获的尿囊液分别标记并于-70℃保存。
3、 MDCK细胞分离
   ① MDCK细胞在培养皿中培养成单层后，用含2μg/mL胰蛋白酶的MEM培养液(无血清)至少洗涤2次；
 ② 使用Pipetty，培养皿每孔加入0.25mL样品，每个样品加3个孔，置37℃二氧化碳细胞培养箱中孵育1h；
 ③ 培养皿每孔加入含0.5 μg/mL胰蛋白酶的MEM培养基，置37℃二氧化碳细胞培养箱培养；
   ④ 每天在显微镜下观察、记录细胞病变情况；
⑤ 当细胞出现肿胀变圆、聚团和崩解(CPE)时，可收集上清液。如无CPE，则7d后收集上清液，进行血凝试验；
⑥ 上清液保存于-70℃。
4、 HA试验
① 使用Pipetty电动移液器，设置连续分液模式，在96孔微量反应板每孔等量加入25μLPBS；
② 每行第1孔中，用Pipetty单次模式加入上述鸡胚尿囊液或MDCK细胞上清液（病毒分离液）25μL，按UP键自动混匀；随后从第1孔吸出25μL液体加于第2孔，混匀后吸出25μL液体加于第3孔，如此进行2倍倍比稀释至第11孔，第11孔弃去25μL液体；第12孔不加抗原，仅加PBS缓冲液，作为阴性对照；
 
③ 每孔中再加25μLuLPBS；
④ 每孔加50μL 1%红细胞悬液，22°C(±2℃)作用30 min，观察HA结果。
5、判定方法
① 当鸡红细胞发生凝集反应时,其均匀分布在微量反应板底部，将微量反应板倾斜45°角20s~30s,红细胞不下滑，即HA阳性；
② 红细胞未出现凝集时，微量反应板倾斜后，可见沉淀的红细胞向下滑动，形成流线或泪滴状，即HA阴性。
③ 样品的HA效价为全部鸡红细胞出现凝集时的最高稀释倍数。
④ 阳性的样品作小量等份(每份1mL)分装,并取其1份测定HA效价,其余样品置一70℃以下保存。 HA阴性的样品尿囊液(或细胞上清)收集在一起，再经鸡胚或MDCK细胞盲传，最多进行5次盲传。如传至第五代仍无血凝活性，可放弃分离病毒。
 
 
四、结果判定
1、 结果成立条件：HA试验中，鸡红细胞对照孔不发生凝集，微量反应板倾斜后，可见沉淀的红细胞向下滑动，形成流线或泪滴状。
2、HA阳性，判定为EIV分离阳性。
3、HA阴性，判定为EIV分离阴性。