方案摘要：本方案整合了Pipetty电动移液器精准控量、连续移液、操作稳定以及防交叉污染等核心优势，对样品处理、RNA提取、反应体系配制等关键操作环节予以规范，规避手动移液过程中易出现的误差、效率低下以及污染风险等问题，充分发挥其移液精准度高、重复性强、操作便捷的特性，确保实验结果的准确性、一致性与可靠性，为马流感的快速、精准检测提供标准化操作依据。适用于动物疫病防控机构、兽医实验室等开展马流感核酸检测工作，有助于提升检测工作的效率与质量。
 
 
方案详情：
一、实验原理
马流感（Equine Influenza, EI）是由马流感病毒（Equine Influenza Virus, EIV）引起的一种急性、高度接触性呼吸道传染病，主要亚型为H3N8，实时荧光RT-PCR技术是基于逆转录（RT）和聚合酶链式反应（PCR）结合荧光信号检测的核酸检测方法，可实现对EIV核酸的快速、灵敏、特异检测。其核心原理为：首先通过逆转录酶将病毒RNA逆转录为cDNA，再以cDNA为模板，利用特异性引物和荧光探针，在PCR仪中进行指数级扩增；扩增过程中，荧光探针与目的片段特异性结合，随着扩增循环的进行，荧光信号不断累积，通过实时检测荧光强度，可定量或定性判断样品中是否含有EIV核酸。
 
 
二、‌实验准备
1、设配和材料
① Pipetty电动移液器MSIC01-03-20、MSIC01-03-250、MSIC01-03-1000；
② 实时荧光PCR仪；
③ 低温台式高速离心机；
④ 瞬时离心机。
 
2、试剂和材料
① 病毒RNA提取试剂盒。
② 一步法荧光RT-PCR试剂盒。
③ 透明薄壁PCR管(0.2mL)或PCR八联管或96孔PCR反应板；
④ 引物和探针；
⑤ 阳性对照:EIV鸡胚/细胞培养物、EIV核酸标准样品/质控品、感染EIV的阳性组织样品、实时荧光RT-PCR阳性对照质粒均可作为阳性对照；
⑥ 阴性对照(DEPC处理水)。
 
 
 
三、实验步骤
1、将采集的拭子样品充分捻动、挤干后，使用Pipetty电动移液器MSIC01-03-1000单次模式，精准移取200μL样品液，转入无菌离心管中，备用。
 

1. 使用病毒RNA提取试剂盒，按试剂盒说明书步骤提取病毒RNA：借助Pipetty电动移液器，精准移取试剂盒中的裂解液、洗涤液等试剂，加入样品液中，充分混匀后经低温台式高速离心机离心处理；最后用移液器移取洗脱液，收集提取的病毒RNA。提取的病毒RNA应立即进行RT-PCR反应，若暂不反应，需置于-70°C冰箱保存。

 
3、实验前将所有试剂置于冰上融化，融化后轻轻颠倒混匀，瞬时离心。计算所需PCR反应管数量，取n+2个PCR反应管（n为待检样品、阳性对照和阴性对照数总和）。按照下表配制反应体系，所有试剂移取均使用对应量程的Pipetty电动移液器，其连续分液模式，不仅可以确保移液精准，避免交叉污染，还能提高实验效率，减少手部负担。
 

1. 将加样后的反应管按顺序放入实时荧光PCR仪中，并按下列程序进行反应:42°C反转录30min，94 °C预变性3 min,进行1个循环;92°C变性10 s,60 °C退火30 s.进行40个循环。

注:反应体系和反应条件，根据所使用实时荧光RT-PCR试剂盒不同，适当调整各试剂用量及反应温度和时间。
 
四、结果判定
1、读取Ct值，阴性对照无Ct值，且无扩增曲线;阳性对照的Ct值≤30.且有特异性扩增曲线。
2、阳性
待检测样品Ct值≤35，且出现特定的扩增曲线，判定为H3N8亚型EIV核酸阳性。
3、阴性
待检测样品无Ct值且无扩增曲线，判定为H3N8亚型EIV核酸阴性。
4、疑似
待检测样品3535,即使出现特异性扩增曲线，仍判定为H3N8亚型EIV核酸阴性。